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ヘム分解酵素の基質選別における膜局在の影響および膜からの遊離に伴う機能変化の解明

研究課題

研究課題/領域番号 23K04964
研究種目

基盤研究(C)

配分区分基金
応募区分一般
審査区分 小区分37030:ケミカルバイオロジー関連
研究機関九州工業大学

研究代表者

平 順一  九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 准教授 (20549612)

研究分担者 杉島 正一  久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
坂本 寛  九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (70309748)
研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2026-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
2025年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2024年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
キーワードヘムオキシゲナーゼ / ヘムシャペロン / リポソーム / チトクロムP450還元酵素 / バイオプローブ / ヘム代謝系 / 細胞内プロテアーゼ / 膜局在
研究開始時の研究の概要

ヘムは重要な生体内反応や細胞機能に関わる補欠分子属であるが、余剰の細胞内ヘムは毒性を示すため、小胞体膜上のヘムオキシゲナーゼ(HO)を中心としたヘム分解系ですみやかに処理される。しかし、ヘムの利用と分解を仕分けるメカニズム、すなわちHOが分解対象のヘムをどのようにして認識・捕捉しているのかは明らかでない。本研究課題では、“HOはなぜ膜上ではたらくのか?”という点に着目して研究を展開する。ヘムが分解系に毒として認識される閾値や認識機構の解明を目指すとともに、HOが本来機能する場所である小胞体膜から離れた際に、ヘムの捕捉や酵素機能に及ぼす影響についても併せて検討する。

研究実績の概要

ヘムは体内の鉄の主要な存在様式であり、ヘムタンパク質の補欠分子族として知られる他、タンパク質と弱く相互作用をすることで様々な細胞機能に関わることも知られはじめている。ヘムは生体にとって不可欠な分子であるが、活性酸素種を触媒的に酸性する危険性も併せ持つ。したがってヘムの同化と異化は厳密に制御され、余剰のヘムは小胞体膜上のヘムオキシゲナーゼ(HO)を中心としたヘム分解系で処理される。HOはNADPHチトクロムP450還元酵素(CPR)による電子の供給を受けてヘムをビリベルジン、一酸化炭素、鉄に分解する。しかし、ヘムの利用と分解を仕分けるメカニズム、すなわちHOが分解対象の流動的ヘムをどのように認識・捕捉しているのかは明らかでない。HOと同様、CPRと共役する点や酸素添加酵素という共通点を持ち、異物の代謝と排出の機能を持つチトクロムP450が、水酸化により異物の極性を高めて解毒を行うことに鑑みると、ヘムの異物としての認識機構は、ヘム分解酵素であるHOが局在化する膜への移行が重要であると考えられる。また、小胞体膜からの遊離がHOの機能を大きく変えることが明らかとされつつある。
本年度、「ヘム代謝系がヘムを捕捉する環境を組み立てて考える」構成論的アプローチに基づき、脂質二重層へのヘムの選択的移行に伴う、HOとの共局在の可能性について検討した。また、HOの膜局在様式に変化をもたらす因子として、膜結合領域近傍の切断に関わるプロテアーゼの探索を行った。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでに平と坂本は、ヘムの結合に伴い蛍光が消光するHOベースのヘムセンサーを開発している。当初の研究計画では、このヘムセンサーを脂質膜上に配置してヘムの結合を評価する予定であった。しかし、ヘム代謝系が膜上のヘムを選択的に補足するという仮説をより強固にするため、まずは脂質二重膜に対するヘムの選択的な結合を評価した。リポソームを用いた実験を行った所、ヘムは脂質膜上に選択的に集積することが示唆された。これまでに得られた結果や文献と統合すると、ヘムシャペロンによるサイトゾルでの保持を受けていないヘムが膜へ移行してHOに補足されるという仮説を証明するピースが揃った。しかし論文としての発表のためにはこれを一つのモデル系として構築し実証する必要がある。
HOの膜結合領域の切断に関わるプロテアーゼの探索は、令和6年度以降に計画していたが、国外のグループとの競合が懸念されたため、この検討を前倒して進めている。酸化ストレスを負荷した線維芽細胞でHOのサイトゾルへの遊離が報告されているが、カルパインやカテプシンといった代表的細胞内プロテアーゼがHOの膜結合ドメインの切断に伴うサイトゾルへの遊離をメディエートする直接的な証拠は得られていない。今年度、ヘムオキシゲナーゼの膜結合ドメイン近傍のポリペプチド鎖が、過酸化水素で処理したマウス線維芽細胞由来のライセートの添加で切断されることを見出した。この切断がどのようなプロテアーゼによって引き起こされるのか、次年度移行検討する必要がある。

今後の研究の推進方策

予備的な実験から、膜結合ドメインを持つHOはリポソーム存在下において、膜結合ドメインを欠くものと比較し、有意にヘムを補足することを見出している。しかし、この時に膜結合ドメインを持つHOがリポソーム上に局在化するエビデンスは未取得である。蛍光あるいは共焦点レーザー顕微鏡を利用してリポソーム上へのヘムセンサーの局在を確認する。リポソーム上に局在化するHOに対するヘム結合に関する定量的なデータを取得する。その後、代表的なヘムシャペロン分子として知られるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼとの間でのヘムの結合の競合性を評価する。一連の検討により「ヘムシャペロンによるサイトゾルでの保持を受けていないヘムが膜へ移行してHOに補足される」という仮説を実証するモデル系が構築され、論文発表が可能なレベルになるものと期待できる。
上記の他、前述の通りHOの膜結合ドメイン近傍のポリペプチド鎖が、過酸化水素処理したマウス線維芽細胞由来のライセートの添加で切断されることを見出した。カルパインやカテプシンなどの代表的な細胞内プロテアーゼについては、選択的阻害剤が市販されていることから、これらを活用してHOのサイトゾルへの遊離に関わる新規細胞内プロテアーゼの探索を試みる。

報告書

(1件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 研究成果

    (9件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (6件)

  • [雑誌論文] Role of tubulin C-terminal tail on mechanical properties of microtubule2024

    • 著者名/発表者名
      Senjuti Nowroz, Syeda Rubaiya Nasrin, Arif Md Rashedul Kabir, Takefumi Yamashita, Tomoichiro Kusumoto, Junichi Taira, Marie Tani, Masatoshi Ichikawa, Kazuki Sada, Akira Kakugo
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 706 ページ: 149761-149761

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2024.149761

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Computational Screening and Experimental Validation of Inhibitor Targeting the Complex Formation of Grb14 and Insulin Receptor2023

    • 著者名/発表者名
      Ochi Yosuke、Matsui Takanori、Inoue Keitaro、Monobe Kohei、Sakamoto Hiroshi、Aoki Shunsuke、Taira Junichi
    • 雑誌名

      Molecules

      巻: 29 号: 1 ページ: 198-198

    • DOI

      10.3390/molecules29010198

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Computer‐Assisted Identification of Inhibitor with Novel Pharmacophore Targeting First Kringle Domain of Hepatocyte Growth Factor2023

    • 著者名/発表者名
      Taira Junichi、Yamaguchi Miho、Tashiro Anju、Kida Asuka、Suzuki Ko、Sakai Katsuya、Matsumoto Kunio、Aoki Shunsuke
    • 雑誌名

      ChemistrySelect

      巻: 8 号: 36

    • DOI

      10.1002/slct.202301577

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 頂点数変化が可能なワイヤーフレム DNAナノ構造の設計 Vertex Switcher2024

    • 著者名/発表者名
      筒井陽一, 越智耀亮, 富永大智, 加藤 恆, 荒木岳士, 坂井惠輔, 吉武鈴之助, 豊成真人, 中茎 隆, 前田和勲, 森本雄祐, 佐藤佑介, 平 順一
    • 学会等名
      第7回分子ロボティクス年次大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 自発形成するDNAナノチューブを足場とした短鎖合成ペプドの集積化2024

    • 著者名/発表者名
      越智耀亮, 五味渕由貴, 井上大介, 安永卓生, 平 順一
    • 学会等名
      第7回分子ロボティクス年次大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 自発的に形成されるDNAナノ構造体上での金ナノ粒子修飾ペプチドの空間配置制御2024

    • 著者名/発表者名
      越智耀亮, 五味渕由貴, 安永卓生, 平 順一
    • 学会等名
      日本化学会 第104春期年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 荷電残基含有Aibヘリックスモデルペプチドにおける疎水性残基導入効果2023

    • 著者名/発表者名
      古賀あみ, 長田聰氏, 山口夏純, 平 順一, 荒本 薫, 関 清彦
    • 学会等名
      第60回化学関連支部合同九州大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 膜局在した誘導型ヘム分解酵素HO-1のヘム捕捉効率評価のためのモデル系の構築2023

    • 著者名/発表者名
      徳永 誠, 山根愼平, 杉島正一, 坂本 寛, 楠本朋一郎, 平 順一
    • 学会等名
      第45回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 計算化学に基づくインスリンシグナル抑制因子Grb14の阻害剤探索2023

    • 著者名/発表者名
      井上敬太郎, 越智耀亮, 坂本 寛, 青木俊介, 松井孝憲, 平 順一
    • 学会等名
      第45回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書

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公開日: 2023-04-13   更新日: 2024-12-25  

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