ロドコッカス宿主の細胞特性を活かした物質変換酵素系の構築

• 研究課題/領域番号: 23K05008
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分38020:応用微生物学関連
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 吉田 豊和 岐阜大学, 工学部, 教授 (90220657)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円); 2025年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
• キーワード: Rhodococcus / 有機溶媒耐性 / 異種発現 / 酵素変換 / 異種遺伝子発現

研究開始時の研究の概要

近年、Rhodococcus属宿主－ベクター系が利用可能となったが、Rhodococcus属細菌の細胞を効果的に活用した物質変換研究は極めて少ない。本研究では、この宿主－ベクター系を酵素による物質変換に適用し、Rhodococcus属細菌の細胞を“物質変換の反応場”として設定する。異種遺伝子の機能発現を検討すると共に有機溶媒耐性を示す細胞特性を活かした難水溶性化合物の物質変換、および物質変換系構築に活用できる細胞内在性NADPH再生系の解明と応用を計画する。汎用されていない新しい宿主細胞の潜在的価値を検証し、活用範囲の拡張と物質変換への応用を目指す。

研究実績の概要

Rhodococcus属宿主の細胞特性を効果的に活用した物質変換を目的とし、当該年度において以下の研究を実施した。
(1)難水溶性化合物イソオイゲノールのバニリンへの変換：まず、Pseudomonas putidaのイソオイゲノールモノオキシゲナーゼ遺伝子を大腸菌に形質転換し、酵素遺伝子が機能発現させ、組換え体培養細胞を酵素変換系に用いた。DMSOなどの有機溶媒存在下（5% v/v）でイソオイゲノールからバニリンが生成することを確認した。その後、イソオイゲノールモノオキシゲナーゼ遺伝子をRhodococcus宿主用ベクターであるpTipRT2に組込み、エレクトロポレーションによりR. erythropolis L88に形質転換した。SDS-PAGEによって酵素遺伝子の発現状況を調査した結果、可溶性画分に酵素タンパク質の発現を認めたが、その発現量は顕著ではなかった。過去にStreptomyces属由来のイミン還元酵素遺伝子がRhodococcus属宿主で高発現した知見を踏まえ、をStreptomyces coelicolorのコドンに最適化したイソオイゲノールモノオキシゲナーゼ遺伝子をデザインした。
(2)難水溶性のアダマンタン誘導体に作用する新奇酵素の機能解明とアミノアダマンタン合成への利用：Arthrobacter属細菌に見出したアダマンタン誘導体に作用するハイドロラーゼの精製と酵素タンパク質同定を進めた。無細胞抽出液を硫安分画後、各種カラムクロマトグラフィーを用い、約630倍にまで部分精製した。全ゲノム解析およびSDS-PAGE後のPMF法によって酵素タンパク質同定を行い。２種のハイドロラーゼ遺伝子候補を見出した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

イソオイゲノールモノオキシゲナーゼ遺伝子のRhodococcus属宿主での発現は良好ではなかったが、想定内の結果であったため、今後にコドンを改変した合成遺伝子での異種発現を検討する。新奇ハイドロラーゼは構成酵素であるため、細胞内含量が少なく酵素精製に時間を要したが、酵素遺伝子候補を絞り込むに至った。

今後の研究の推進方策

難水溶性イソオイゲノールのバニリンへの変換については、合成遺伝子のRhodococcus宿主での高発現を検討した後、有機溶媒耐性を示す宿主細胞の特性を活かして、高濃度の有機溶媒存在下でバニリンの酵素合成を検討する。大腸菌宿主での酵素合成と比較し、Rhodococcus宿主の優位性を検証する。難水溶性のアダマンタン誘導体に作用する新奇ハイドロラーゼについても、酵素遺伝子を同定した後、大腸菌およびRhodococcus宿主での遺伝子の異種発現を検討する。これらの検討を通して、Rhodococcus宿主細胞の有用性の一般化を図る。