植物のフラボノイドＣ配糖化酵素とＯ配糖化酵素の基質認識機構の解析と活性の転換

研究課題

研究課題/領域番号	23K05038
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分38030:応用生物化学関連
研究機関	信州大学
研究代表者	田口悟朗信州大学, 学術研究院繊維学系, 教授 (70252070)
研究分担者	新井亮一信州大学, 学術研究院繊維学系, 准教授 (50344023)
研究期間 (年度)	2023-04-01 – 2026-03-31
研究課題ステータス	交付 (2023年度)
配分額 *注記	4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円) 2025年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円) 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円) 2023年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
キーワード	C-配糖化酵素 / C-配糖体 / C配糖化酵素 / 酵素反応機構 / 結晶構造解析
研究開始時の研究の概要	「Ｃ配糖体」は芳香環に糖が直接炭素－炭素結合した化合物であり、一般的な「Ο配糖体」と比べると分解されにくく生物活性が高いものも多い。本研究は、Ｃ配糖体の合成を触媒する植物の「Ｃ配糖化酵素」が炭素－炭素結合を作る反応の仕組みを解明し、Ｏ配糖化酵素との違いを明らかにすることを目的とする。また、その結果をもとにＯ配糖化酵素からＣ配糖化活性を持つ酵素へ活性の転換を試みる。本研究の成果は有用なＣ配糖体の合成などに繋がることが期待される。
研究実績の概要	フラボノイドなどの芳香環に糖が直接結合した「Ｃ配糖体」は、その安定性や生物活性の高さなどから近年注目されている化合物群である。これらの生合成を担う植物のＣ配糖化酵素の多くはUGT708グループに属するが、それには属さずＯ配糖化酵素からＣ配糖化酵素に分子進化したと考えられる酵素もいくつか報告されている。本研究では、その一つであるワサビ由来のフラボノイド6-Ｃ配糖化酵素WjGT1についてその基質の認識機構を明らかにするとともに、同様にＯ配糖化酵素から分子進化したと考えられるＣ配糖化酵素を単離して解析し、Ｃ配糖化活性に関わる要因を探索することを目的とする。先行研究から引き続きワサビのWjGT1変異体の結晶化を試みているが、結晶の形成に至っていない。そのため、これまでに作出している6-Ｃ配糖化活性を示すように改変されたＯ配糖化酵素について併せてタンパク質の大量発現条件を検討し、結晶構造解析に向けた準備を進めた。また、Ｏ配糖化酵素から分子進化したと考えられるＣ配糖化酵素の探索のため、弱いＣ配糖化活性を示すことが報告されているシロイヌナズナの配糖化酵素遺伝子を単離して大腸菌で発現させ、その反応性を解析した。この酵素は、フラボノイドに対するＯ配糖化活性を示したが、Ｃ配糖化活性は確認できなかったため、さらなる解析が必要である。さらに、フラボノイド6-Ｃ配糖体を蓄積することが報告されている植物について、成分の解析を行った。その結果、過去の報告とは異なり葉にフラボノイドＣ配糖体が大量に蓄積されていることが明らかになった。その構造の解析を進めて、酵素遺伝子単離のための基礎情報を獲得した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由先行研究で予定していた結晶化に成功していないため、その解析を進めるとともに別の類似した酵素での解析を併せて進めている。一方、Ｃ配糖化酵素の探索はほぼ予定通りに進めることができている。そのため、上記のように評価した。
今後の研究の推進方策	引き続き、計画に従って6-Ｃ配糖化酵素の結晶作成および構造解析をすすめるとともに、新規のＣ配糖化酵素のクローニングと機能解析、Ｏ配糖化酵素とＣ配糖化活性の活性変換研究を行う。結晶構造解析については、本年度すでに検討を始めた類縁の「6-Ｃ配糖化活性を示すように改変した酵素」についても併せて結晶作成を進め、いずれかにおいて基質と結合した結晶構造の解析を目指す。新規のＣ配糖化酵素の探索では、Ｃ配糖体を蓄積する葉からの遺伝子のクローニングと異種宿主発現させた酵素の機能解析を行う。Ｏ配糖化酵素をＣ配糖化活性を示す酵素に活性変換する研究については、新たにいくつかの酵素に変異導入して活性を評価するとともに、これまでの変異導入でＣ配糖化活性を示さなかった酵素にさらなる変異導入を行って活性を検証し、Ｃ配糖化活性に必要な要因を解析する。