| 研究課題/領域番号 |
23K05252
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分39050:昆虫科学関連
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| 研究機関 | 宇都宮大学 |
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研究代表者 |
岩永 将司 宇都宮大学, 農学部, 教授 (40400717)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 昆虫ウイルス / 持続感染 / ベクター / 潜在感染ウイルス / 昆虫 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
昆虫や昆虫由来培養細胞を宿主として利用するバキュロウイルス発現系は、多くの獣医薬、医薬、臨床検査用診断薬の生産系として利用されている。しかしながら、バキュロウイルスの感染は激しく致死的であるため、組換えタンパク質が分解されるなどの課題も多い。一方で、申請者らが見出した新規RNAウイルスは、潜在感染型のRNAウイルスであり、生殖巣・卵を介して次世代へと垂直伝播する。そこで、本ウイルスの特長を活かした新しいウイルスベクターを開発する。更に、本ウイルスの潜在感染がバキュロウイルス発現系等に及ぼす影響を排除するため、本ウイルスの安全性を評価し、ウイルスの不活化法を開発する。
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| 研究実績の概要 |
本年度は、Bombyx mori iflavirus variant1（BmIV1）とBombyx mori taarstrup virus（BmTV）についてベクター化を目指した研究を進めた。
BmIV1については、まず、全長cDNAを獲得するため、ウイルス粒子が含まれる培養上清からウイルス粒子を粗精製し、RNAを抽出した。得られたRNAを基に5´RACEと3´RACEを行うことで、これまでに知られていない末端領域を同定することが出来た。その結果、5´側には２回の特徴的な繰り返し配列が含まれていることが明らかとなり、RNAの二次構造予測が特徴的なステムループ構造の存在を示した。次に、BmIV1の導入実験を行うため、多くの培養細胞をチェックすることでBmIV1陰性の培養細胞BmU-を得た。更に、調整し、得られた全長RNAをplasmid DNAに挿入し、BmU-細胞へのトランスフェクションによる感染性の確認を試みたが、感染性の確認には至らなかった。一方で、BmU-細胞にBmIV1を接種し維持継代することでBmU+細胞を調整し、BmU-細胞と比較した結果、細胞の増殖速度に全く違いが認められないことが明らかとなった。
また、本年度はBmIV1ポリプロテインのプロセッシング機構の解析にも取り組んだ。そのために、予測プロセッシング領域を一過性発現させタグの抗体を用いることでプロセッシングの有無を調べる実験系を構築した。次に、構築した実験系を用いてBmU-細胞、BmU+細胞、更にBmU-細胞へとBmIV1を急性感染した細胞でプロセッシングの調査を行ったが、プロセッシングを確認することは出来ず、BmIV1ポリプロテインはトランスではなくシスでプロセスされると予測された。
また、BmTVについても同様に、5´RACEと3´RACEによって全長のcDNA配列を決定した。更に、BmTV陰性細胞へとBmTVを接種する感染実験系の構築に成功した。得られたcDNA配列を詳細に調査した結果、BmTVはこれまでに知られているラブドウイルスとは異なる新規のものであることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、研究目的遂行のためにBmIV1とBmTVの基礎的な情報、感染実験系などの構築に成功した。また、感染性は確認できていないもののBmIV1については既に全長のcDNAを有するplasmid DNAの構築も出来ており、今後はin vitro転写によるRNA導入などの実験が可能となった。そのため、本年度は概ね順調に研究が進展していると自己評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、BmIV1についてはin vitro転写によるRNA導入を進めるとともに、導入RNAが翻訳されているかどうかを明らかにするためのFLAGタグ導入実験に取り組む。更に、BmIV1の抗体も作製するとともに、BmIV1の安全性評価についても解析を進める。一方で、BmTVについても抗体を作成するとともにその安全性評価に取り組む。得られた結果について学会や論文発表を行う。
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