| 研究課題/領域番号 |
23K05622
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42040:実験動物学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
持田 慶司 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 特別嘱託技師 (60312287)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | 卵巣移植 / 野生由来マウス / 高齢マウス / 系統保存 / 凍結保存 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
加齢マウスの卵巣を若いマウスに移植すると産子数が増加すると報告されている。この卵巣置換がドナー個体の欠点を補う点に注目し、過排卵が効かない、受精しない、胚が発生しない、着床から産子発生が困難な場合等に、ホストの身体を利用した繁殖成績の改善が期待できる。
本課題では、(1)亜種・異種・加齢マウスの卵巣移植を行い、実験用マウス体内で過排卵を実現させる、(2)異種の体内で人工授精による受精卵作出および産子発生を実現させる、そして最終的には(3)凍結保存した卵巣および精子を用いて産子獲得を行う。
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| 研究実績の概要 |
本研究は卵巣組織の未熟な卵胞を最大限に利用してマウス生体を作出することを目的として、(1)卵巣移植による基本的成績の検討、(2)亜種系統、(3)加齢マウス、(4)異種マウスとの卵巣移植成績の検討、(5)凍結卵巣移植と人工授精による産子作出を進める。まず(1)卵巣移植成績の検討として、C57BL/6（以下B6）-GFP系統の卵巣を摘出し、卵巣をおおよそ除去したB6系統の卵巣嚢の中に移植を行い、B6雄と交配させたところ、平均8匹の子が得られ、そのうち移植卵巣由来のGFP陽性の子は5.8匹（78％）であった。これは前年度の結果の5.5匹（GFP陽性は3.3匹）よりも改善された。更に産子数を増加する効果のある抗インヒビンモノクローナル抗体（AIMA）を投与することで、産子数は9.6匹となり、当初の目標の10匹と同等であったGFP陽性の子も5腹のうち2腹で10匹以上（平均6.6匹）と好成績が得られた。次に(2)亜種系統であるJF1系統（M. m. molosinus、有色）と(4)異種であるSPR2系統（M. spretus、有色）の卵巣をNOD/scid系統の雌（M. m. domesticus、アルビノ）へ移植してICR系統（アルビノ）の雄と交配させたところ、どちらも移植卵巣由来の産子（有色の仔）の作出に成功した。(5)凍結卵巣移植から産子が得られることも確認できた。一方で、凍結受精卵から産子作出が困難なDBA/2系統の凍結精子を用いてICR系統雌で人工授精を行ったところ、受精率は73%であり、平均9匹の産子が得られた。今後は最終的に凍結卵巣と凍結精子の組み合わせによる新しい近交系マウスの産子作出法の検討を進める予定である。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
まず卵巣移植のホストとして免疫不全マウスであるNOD/scid系統にレンチウイルスを用いてNEON-GFP遺伝子を導入し、NOD/scid-GFPマウスの作出を試みたが、実際のマウスはGFPの蛍光発色が弱かったことから、NOD/scid雌マウスを用いてC57BL/6(以下B6)-GFP雄マウスとの交配によるGFP発現を指標としたコンジェニック化を進めた。N4世代を利用してホモ動物が得られるまで、１年半を要したことから、一部の実験で遅延が生じた。現在までの実験経過として(1)卵巣移植から産子作出について、B6-GFP系統をホストとして卵巣移植の最適条件の検討を進めたところ、卵巣摘出から移植までの時間を短くすることで産子数が改善され、通常の平均産子数（8.6匹）に匹敵する産子数が得られた。更に産子数を増大させる効果のあるAIMAを投与することで9.6匹に増大し、基本的成績を大きく改善することに成功した。(2)と(4)の亜種および異種系統の卵巣移植にもB6-GFP系統のホストを用い、卵巣移植後にICR系統の雄との交配でF1産子が得られた。移植した卵巣を介した亜種間および異種間マウス作出の最初の実例と言える。(3)加齢マウスの卵巣移植は、NOD/scid-GFPマウスの作出に時間を要したことから未着手である。そのために前倒しで開始した(5)卵巣凍結は既報のプロトコールを参考に行ったところ順調に進み、凍結卵巣由来の産子作出に成功した（参考にした論文では卵巣移植は行っていない）。特に人工授精の検討は複数の近交系および新鮮と凍結精子を用いて予備実験を進めてきた。その結果、凍結-融解後も精子の活性の高い系統では、排卵した雌の卵管内へ凍結-融解した精子を注入する人工授精によって受精卵および産子の獲得に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)基本的成績の検討では、引き続きB6系統へのB6-GFP卵巣の移植を行い、産子数増加に効果のあるAIMA投与の有無による産子数への効果と移植した卵巣の発育状態の解析を進める。(2)と(4)の亜種および異種系統も引き続きNOD/scid-GFPマウスへ卵巣移植を行い、亜種または異種雄との交配による亜種および異種系統自体の産子作出を目指す。以上の実験は、例数を増やすことで新規性およびインパクトのある論文として公開する予定である。また、JF1やSPR2系統および(3)の加齢マウスのように一般的な過排卵法では多く排卵されないケースでも、過排卵が効果的なホスト（若いB6やNOD/scid-GFP）マウスに卵巣を移植することで、ホルモン投与による過排卵が可能かどうか、卵巣の効果的利用の可能性を検証する。特に加齢の影響については約1年の雌マウスへ抗インヒビン血清（AIS）を投与すると排卵数が5個から13個に倍増することが予備試験から分かっていることから、約10週齢の雌マウスの卵巣を移植したホストマウスへAISを投与して自分のFSHを過剰に分泌させる機能が働くか否かを検証する予定である。(5)凍結卵巣移植と人工授精による産子作出についてもそれぞれ検討を進める。まず現在良好と考えている方法で凍結-融解した卵巣をNOD/scid-GFPマウスへ移植してAIMA投与後に自然交配させて凍結保存の影響を検討する。一方で人工授精の条件検討を引き続き進めて、B6およびDBA/2、Aの各系統の成績を検証する。そして最終的には凍結卵巣の移植と、凍結精子を用いた人工授精によって近交系マウスの系統保存を成功させたい。特にDBA/2やA系統は凍結胚から産子発生が困難な系統であり、近交系マウスの新しい保存方法の確立が期待される。
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