| 研究課題/領域番号 |
23K05728
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43050:ゲノム生物学関連
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
鵜木 元香 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (30525374)
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| 研究分担者 |
藤本 明洋 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (30525853)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | DNAメチル化 / DNMT3B / セントロメア / ペリセントロメア / 非コードRNA / ICF症候群 / MLID / 染色体 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
染色体のセントロメア・ペリセントロメア領域は反復配列から構成される染色体構造を保つ上で重要な領域で、高度にメチル化されてヘテロクロマチン化している。研究代表者はこれまでの研究で、本領域が低メチル化するICF症候群患者細胞のみならず、健常人細胞においても、本領域から一定量の非コードRNAが転写されている事に気が付いた。分裂酵母では本領域からの転写が引き金となってヘテロクロマチンが形成されるが、哺乳類細胞におけるヘテロクロマチン化機構は不明点が多い。そこで本研究では、哺乳類細胞で本領域から転写された非コードRNAがDNAメチル化に関与するか、するのであればその機構はどのようなものかを調べる。
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| 研究実績の概要 |
今年度は、DNMT3Bが（ペリ）セントロメア反復配列由来の非コードRNAと相互作用する可能性があるかを検討した。正常人と1型ICF症候群患者由来のB細胞株を用いたDNMT3Bの公開RIP-seqデータ（Gatto et al, 2017）を入手し、データの再解析を行った結果、患者由来株においてDNMT3Bとの結合が増加したRNAの中に、複数のセントロメア反復配列（CER）が含まれていた。これは、当該領域の低メチル化に伴う転写の増加を反映しているものと考えられる。DNMT3Bと結合していたCERは76 bpから83 bpで多くの多型を含んでいたが、コンピューターシミュレーションにより、どのCERもmiRNA様の高次構造をとることが予測された。よってDNMT3Bは（ペリ）セントロメア反復配列由来RNAの一次配列もしくは高次構造を認識し、de novo DNAメチル化酵素活性で、当該領域をメチル化する可能性がある。今回検出されたRNAが高次構造をとり、DicerにプロセシングされてsiRNAとなり、DNMT3BがDicerとの相互作用を介してsiRNAを認識する可能性も考えられたため（Dicerは主に細胞質で機能するが、一部核にも局在するため）、DNMT3BとDicerの相互作用を免疫沈降にて調べたが、DNMT3BはDicerと共沈してこなかった。なお、DNMT1及びUHRF1もDicerと共沈してこなかった。また本研究費の一部で、細胞質に局在する蛋白質の異常が低メチル化を引き起こすMLIDという先天性疾患の分子病態機構の解明も行い、全く新しいDNAメチル化機構の一部を明らかにすることに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ペリセントロメア・セントロメア反復配列から転写されたサテライトRNAとDNMT3Bが結合する可能性がRIP-seq dataから示唆され、その結合の生物学的意義の証明に向けた準備が整いつつあるため。また、非コードRNAを介してではないが、細胞質タンパク質が関与するDNAメチル化機構という全く新しいDNAメチル化の維持機構を明らかにすることができたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
ビオチン化サテライトRNAをin vitro合成し、DNMT3Bとの結合をEMSAなどにより検討する。またどのような高次構造をとると、サテライトRNAとの結合が促進されるのかなども併せて検討する。また、DNMT3BがサテライトRNAと結合するタンパク質領域を、DNMT3Bのdeletion mutantを作って検討する。サテライトRNAとの結合領域が決定できたら、その領域を変異させたDNMT3Bを発現する細胞株を樹立し、サテライトRNAとの相互作用が当該領域のメチル化維持に必要かどうかを、バイサルファイトシークエンスなどで検討する。
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