| 研究課題/領域番号 |
23K06004
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分46030:神経機能学関連
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
吉田 崇将 帝京大学, 医学部, 助教 (50525904)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2025年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
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| キーワード | 広域カルシウムイメージング / 多波長蛍光イメージング / カルシウム感受性蛍光タンパク質 (GECI) / マウス / 大脳皮質 / オペラント条件付けタスク / 感覚統合 / カルシウムイメージング / マクロイメージング |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、感覚統合の神経メカニズムを解明するために、感覚統合を誘起する行動タスクをマウスに学習させ、タスク中の大脳皮質における神経活動を広域カルシウムイメージングを用いて計測することで、感覚統合関連神経活動とその発現部位を明らかにすることを目的とする。一方、広域イメージングデータは、行動を担う皮質サブネットワークの入力・中継・出力が混ざり合って観察され、かつ、マウスが実験者が意図しない行動を取ることで神経活動も大きく変容してしまうため、その解釈が非常に難しい。そこで、遺伝学的ツールによって皮質サブネットワークを区別した上で、ビデオによる行動解析を組み合わせることでこれらの問題の解決を図る。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、感覚統合の神経メカニズムを解明するために、感覚統合を誘起する行動タスクをマウスに学習させ、タスク中の大脳皮質における神経活動を広域カルシウムイメージングを用いて計測することで、感覚統合関連神経活動とその発現部位を明らかにすることを目的とする。しかし、広域イメージングデータは、行動を担う皮質サブネットワークの活動が混ざり合って観察され、かつ、マウスが実験者が意図しない行動を取ることで神経活動も大きく変容してしまうため、その解釈が極めて困難となる。そこで、遺伝学的ツールによって皮質サブネットワークを区別した上で、ビデオによる行動解析を組み合わせることでこれらの問題の解決を図る。
令和５年度は、多波長蛍光イメージングを行うための新しいマクロ顕微鏡システムを構築し、その検証を行なった。YC2.60およびGCaMP6sのGECIマウスを用いて、CFP/GFP波長帯では蛍光イメージの撮影に成功した。さらに、取得したイメージングデータを処理・解析するためのMATLABプログラムを作成した。解析プログラムは、過去取得済みのデータに適用し、その一部の成果は学会（第101回日本生理学会大会）で発表した。また、大脳皮質サブネットワークを区別するための新たなドライバーTgマウスを設計し、先端モデル動物支援プラットフォーム（AdAMS）・モデル動物作製支援による作製を依頼した（現在作製中）。このドライバーマウスは、興奮性細胞特異的かつtTA依存的に、さらに抑制性細胞特異的かつCre依存的にさらに遺伝子発現を制御するもので、GECIのfloxまたはTREマウスと掛け合わせて、細胞腫依存的に多色の蛍光タンパク質の発現を同一個体で実現するものである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では、広域カルシウムイメージングが本質的に抱える問題を段階的に解決してそのデータ解釈の困難さを解消することで、感覚統合の神経メカニズムの解明を目指す。その問題には以下のようなものが考えられる：①感覚統合の一連の神経プロセスを担う皮質サブネットワークの階層（入力・中継・出力）が混ざり合って観察され分離が困難である。②感覚統合メカニズムへの関連が示唆されている抑制性細胞の活動と興奮性細胞の活動を同時に区別しながら観察できない。③タスクの実行中にはマウスは実験者が意図しない行動も取っており、それによって神経活動も広範囲にわたり大きく変容する。
問題①に関しては、多くのTg系統を使用する必要があり、入手から維持に至るまで莫大なコストがかかることが判明したため、当面は問題②に関するTgマウス作製を優先させることにした。その進捗は前述の通りである。また、イメージングシステムの構築に関して、RFP波長帯のシステム構築と検証が未完であり、したがってCFP/GFP・RFP波長帯の組合せ同時計測も未完である。問題③に関しては、マウスの行動モニタリングシステム（瞳孔および全身のトラッキング）を現在構築中であり、タスクシステム自体は完成しているが、その稼働はまだである。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在作製中のTgマウスが完成したら、既存のGECIマウス（flox-GCaMP6s、flox-YC2.60またはTRE-YC2.60）とAAV（AAV-Syn-flex-jRGECO1a）の皮質内注入を用いて、CFP/GFP・RFP波長帯の組合せ同時イメージングを検証する。そのためのRFP波長帯のシステム構築を優先する。これにより、まずは興奮性および抑制性皮質神経のサブネットワークを区別しながらイメージングする系を立ち上げる。
頭部固定下におけるマウスの行動をモニタリングするシステムを構築する。嵩上げした透明アクリル製のステージに保定筒を設置し、保定筒に入れたマウスの身体の動きを腹側からカメラで撮影する。マウスの眼球にフォーカスしたマクロレンズとカメラを通して瞳孔を撮影し、瞳孔径の変化を抽出する。マウスは暗室で固定するため、赤外線LEDによる照明を施す。マウスの行動および瞳孔の動画は、DeepLabCutを用いて分析し、トラッキングする。
タスクシステムを稼働する。感覚統合を誘導するための視聴覚弁別タスクを、左右舐め分けの二肢強制選択タイプに改変して実施する。二肢強制選択が難しい場合は、まずはGo/No-goタイプで試す。トレーニングでは視覚（縦縞・横縞）または聴覚（高音・低音）のユニモーダルな刺激で左右の舐め分けをそれぞれの感覚モダリティで学習させ、テストでは視聴覚刺激の組み合わせにより、判断が明確になるもの(Congruent)と曖昧になるもの(Incongruent) の２つの条件を作り、条件間の行動と神経活動の変化を抽出する。
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