体内時計異常が引き起こす軟骨細胞の劣化および変形性関節症の機序解明

研究課題

研究課題/領域番号	23K06259
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分47060:医療薬学関連
研究機関	山陽小野田市立山口東京理科大学
研究代表者	牛島健太郎山陽小野田市立山口東京理科大学, 薬学部, 教授 (70448843)
研究期間 (年度)	2023-04-01 – 2026-03-31
研究課題ステータス	交付 (2023年度)
配分額 *注記	4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円) 2025年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円) 2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円) 2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
キーワード	変形性膝関節症 / 時計遺伝子 / microRNA / バイオマーカー / BMAL1 / マイクロRNA / 細胞外小胞
研究開始時の研究の概要	体内時計の乱れが引き起こす健康障害について、近年では変形性関節症も体内時計の乱れに起因することが示唆されている。応募者は基礎研究において、時計遺伝子 BMAL1 をノックダウンした軟骨細胞では、スフェロイド形成能が低下することを見出した。さらに、BMAL1 ノックダウン細胞は細胞内脂質小胞の形成が少なく、細胞劣化が進んでいることを明らかにした。本研究では、BMAL1 発現低下を来す軟骨細胞に特異的なメカニズムを明らかにし、BMAL1 の是正が OA の病態を改善することを明らかにする。加えて、軟骨細胞内 BMAL1 発現量を評価できるバイオマーカーを探索する。
研究実績の概要	健常者由来軟骨細胞 (N細胞) と OA 患者由来軟骨細胞 (OA細胞) を、ナノファイバーを用いて 3 次元培養した。各細胞から small RNAs を抽出し、miRNA-シーケンス解析にて miRNAs 発現量を網羅的に測定した。その結果、OA 細胞において N 細胞よりも発現量が高く、かつ qPCRにて定量可能であった miRNAs は 15 種類であった。これら 15 種類の miRNAs と BMAL1 との関係性を明らかにするため、N細胞に対して siRNA を処置して BMAL1 ノックダウン細胞を作製した。前述と同様に細胞から small RNAs を抽出し、前述のバイオマーカー候補 15 種類の miRNAs 発現量を qPCR にて測定した。その結果、BMAL1 ノックダウンにより 4 種類の miRNAs の発現量が増加することが明らかとなった。これら miRNAs のうち、3 種類は直接的または間接的に骨形成に必須の転写因子R の発現に作用することが報告されている。また、残りの 1 種類は概日リズム経路との関連が示されている。さらに、OA細胞において N細胞よりも細胞内発現量が少ない miRNAs も複数種類見出している。OA細胞で発現量が低い miRNAs のうち、BMAL1 ノックダウンによっても発現が低下する miRNAs は軟骨細胞活性を反映する可能性がある。 BMAL1 ノックダウンによって発現量が増加または減少 miRNAs について、細胞内発現量の変化を細胞外から観察するために、培養液中から細胞外小胞を分離して small RNAs を抽出し、qPCR にて miRNAs 発現量を測定した。この測定において、正確性が高く定量可能であった miRNAs は、OA 病態を反映するバイオマーカーになると期待される。以上より、本研究で抽出した miRNAs を組み合わせることで、作業仮説である体内時計障害と軟骨細胞活性の両方を評価できるものと期待される。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初の計画通りに、おおむね順調に研究が進行している。
今後の研究の推進方策	2024 年度には、BMAL1 発現量変化に反応する miRNAs の細胞内機能解析の検討を行う予定である。具体的には、BMAL1 ノックダウン軟骨細胞に対して、本研究で注目する miRNA に対する inhibitor または mimic を添加し、軟骨細胞機能が改善することを明らかにする。具体的には、細胞分化・増殖活性に加えて、3 次元培養時におけるスフェロイド形成能、2 型コラーゲン産生能について評価する。さらに、OA患者の血清試料を用いたバイオマーカー探索研究も開始する予定である。