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ミトコンドリア-ER接触場(MAM)の光顕-電顕相関観察による構造的多様性解析

研究課題

研究課題/領域番号 23K06329
研究種目

基盤研究(C)

配分区分基金
応募区分一般
審査区分 小区分48010:解剖学関連
研究機関久留米大学

研究代表者

太田 啓介  久留米大学, 医学部, 教授 (00258401)

研究分担者 伴 匡人  久留米大学, 分子生命科学研究所, 准教授 (00579667)
研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2026-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2025年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円)
2024年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2023年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
キーワードMAM / ミトコンドリア / オルガネラ間接触 / CLEM / コンタクトサイト
研究開始時の研究の概要

細胞内ではミトコンドリアと小胞体が頻繁に接触している。近年この接触場に様々な分子が集まり、代謝障害など病気にも関係することが指摘されている。現在この接触場を光学顕微鏡で可視化する方法がいくつも開発され、これにより細胞機能との関連が評価されている。しかし、光学顕微鏡で捉えた機能的な接触場が、はたして電子顕微鏡レベルでどのような姿なのかは十分評価されていない。我々はこれまでに、光学顕微鏡で観察した場所そのものを同じ試料上で電子顕微鏡観察し、三次元的に比較検討できる3D-CLEMという新しい技術を開発してきた。本研究は、この技術を使い光学顕微鏡的に検出される接触場の本当の姿を明らかにするものである。

研究実績の概要

ミトコンドリア小胞体接触場Mitochondria associated membrane; MAMは単に小胞体とミトコンドリアが接触するだけでなく、ミトコンドリア外膜表面に様々なシグナル分子が集まる特別な膜ドメインとして生物学的にも疾患との関連性からも注目されている。そのためMAM観察用に光学顕微鏡レベルの様々なレポーターが開発され細胞機能との関連を評価に利用されているが、これらのレポーターで検出されるMAMが電子顕微鏡レベルでどのような構造と一致するのか十分評価されていない。本課題は3次元光顕-電顕相関顕微鏡(3D-CLEM)技術を用いて、光学顕微鏡レベルで評価されているMAMが電子顕微鏡レベルでどのような構造に相当するのかを同一試料上で相関観察し、各レポーターで検出されるMAMの構造的特徴を明らかにしMAMの多様性と機能との相関を試みるものである。今年度は、MAMレポータの収集(split GFP、NanoBiTを用いたMAMマーカーおよび近接ライゲーションアッセイ)を行うとともに、MAM検出に特化した免疫組織化学的3D-CLEM法の開発および、培養細胞用Array tomography法の歩留まり向上(細胞のすべてを余す所なく連続切片として取得し、かつ正確なアライメントを行うマーカー作製技術を確立した)、Array tomography法を用いて電子顕微鏡レベルで検出される3次元的なMAM構造の自動検出を目指したAIモデル作製を中心に進め、様々な状況に対応した学習データを取得するとともに、汎用的MAM検出モデル作製の実証を行った。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本課題の根幹となるArray tomographyを用いたCLEMについては、連続切片の作製技術の大幅な改善による歩留まり向上が達成できた。また、免疫組織化学的CLEMに必須なラベリングについても実証が進みつつあり、概ね順調である。AIについては、ステップワイズAI学習において、どのようなトレーニングデータが必要かについて基礎的な検証を重ね、条件が異なっても同じモデルを用いて比較検討ができる識別モデルを作る手順が確立した。この様に技術的な側面はすべてクリアしつつあるといえる。
一方プローブについては、新しく入手すべきプローブについても、プローブ開発者と直接コンタクトを取ることができ、分与いただく方向で調整ができた。
以上の根拠から概ね順調に進展していると考える。

今後の研究の推進方策

3D CLEMは、包埋前の光学顕微鏡観察と、FIB-SEMもしくはArray tomographyとの組み合わせによるCLEMを想定していたが、より詳細な位置情報が得られるin-Resin CLEM法の応用を検討している。そのための新しい色素を導入し、現在検証を進めている。
また、免疫組織科学的手法とのCLEMでは形態保存の問題があり、十分な形態保存が可能かどうかを検討している。特に、固定については、形態保存を優先した場合に検出が難しくなる可能性が高く、現在、新しい固定法および、比較的弱い固定でも良い形態保存が望める試料作製法を検討しており、比較的良好な結果を得ている。
本課題では、この方法をCLEMに応用することを検討しており、今年度後半は特に免疫組織科学的手法と組み合わせたCLEMによるMAMの同定をすすめていく。

報告書

(1件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 研究成果

    (13件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (8件) (うち招待講演 3件)

  • [雑誌論文] Three‐dimensional ultrastructural and anatomical analysis of prostatic neuroendocrine cells in mice2024

    • 著者名/発表者名
      Uemura Kei‐Ichiro、Togo Akinobu、Hiroshige Tasuku、Ohta Keisuke、Ueda Kosuke、Nishihara Kiyoaki、Nakiri Makoto、Hirashima Shingo、Igawa Tsukasa、Nakamura Kei‐Ichiro
    • 雑誌名

      The Prostate

      巻: 84 号: 9 ページ: 866-876

    • DOI

      10.1002/pros.24705

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] 補助治具を用いたSEM観察用準超薄連続切片の作製手法2023

    • 著者名/発表者名
      若崎 眞由美、武田-神谷 紀子、佐藤 繭子、太田 啓介、豊岡 公徳
    • 雑誌名

      顕微鏡

      巻: 58 号: 3 ページ: 123-127

    • DOI

      10.11410/kenbikyo.58.3_123

    • ISSN
      1349-0958, 2434-2386
    • 年月日
      2023-12-30
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [雑誌論文] Three-Dimensional Ultrastructural and Volume Analysis of the Redundant Nuclear Envelope of Developing and Matured Sperm in Mice2023

    • 著者名/発表者名
      Uemura Kei-ichiro、Miyazono Yoshihiro、Hiroshige Tasuku、Ohta Keisuke、Ueda Kosuke、Nishihara Kiyoaki、Nakiri Makoto、Hirashima Shingo、Igawa Tsukasa、Nakamura Kei-ichiro
    • 雑誌名

      Microscopy and Microanalysis

      巻: 29 号: 2 ページ: 832-840

    • DOI

      10.1093/micmic/ozad003

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Three-dimensional architecture and assembly mechanism of the egg-shaped shell in testate amoeba Paulinella micropora2023

    • 著者名/発表者名
      Nomura Mami、Ohta Keisuke、Nishigami Yukinori、Nakayama Takuro、Nakamura Kei-Ichiro、Tadakuma Kenjiro、Galipon Josephine
    • 雑誌名

      Frontiers in Cell and Developmental Biology

      巻: 11 ページ: 1232685-1232685

    • DOI

      10.3389/fcell.2023.1232685

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Behavioral and neurological effects of Vrk1 deficiency in zebrafish2023

    • 著者名/発表者名
      Carrasco Apolinario Magdeline E.、Umeda Ryohei、Teranishi Hitoshi、Shan Mengting、Phurpa、Sebastian Wulan Apridita、Lai Shaohong、Shimizu Nobuyuki、Shiraishi Hiroshi、Shikano Kenshiro、Hikida Takatoshi、Hanada Toshikatsu、Ohta Keisuke、Hanada Reiko
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 675 ページ: 10-18

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2023.07.005

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 考える細胞 考える組織2024

    • 著者名/発表者名
      太田啓介
    • 学会等名
      第18回久留米大学高次脳疾患研究所市民公開講座, 久留米
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] エチレングリコール誘導腎障害モデルにおける近位尿細管の微細変化12023

    • 著者名/発表者名
      糸山貴子, 都合亜記暢, 船津貴志, 太田啓介
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会第79回学術講演会, 島根
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 試料包埋用樹脂の電子線ダメージによる変形2023

    • 著者名/発表者名
      太田啓介, 都合亜記暢
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会 2023年度 第1回ソフトマテリアル分科会講演会, 東京
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 樹脂包埋生物試料SEM組織像観察のかんどころ2023

    • 著者名/発表者名
      太田啓介
    • 学会等名
      SCANTECH2023、東京
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] エチレングリコール誘導腎障害における近位尿細管ミトコンドリアの三次元的形態変化2023

    • 著者名/発表者名
      太田啓介
    • 学会等名
      トコンドリア・サイエンス・ワークショップ2023, 長崎
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 電子顕微鏡画像のAIセグメンテーションモデルのトレーニング実践2023

    • 著者名/発表者名
      太田啓介
    • 学会等名
      第55 回日本臨床分子形態学会学術集会, 福岡
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 止めない600枚連続超薄切片作製TIPS2023

    • 著者名/発表者名
      太田啓介
    • 学会等名
      電子顕微鏡学会多次元相関顕微鏡第一回研究会, 和光
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] ディープラーニングセグメンテーションのための適切なステップワイズトレーニングと転移学習2023

    • 著者名/発表者名
      太田啓介
    • 学会等名
      日本顕微鏡学会第65回九州支部学術講演会, 北九州
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書

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公開日: 2023-04-13   更新日: 2024-12-25  

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