| 研究課題/領域番号 |
23K06329
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分48010:解剖学関連
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
太田 啓介 久留米大学, 医学部, 教授 (00258401)
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| 研究分担者 |
伴 匡人 久留米大学, 分子生命科学研究所, 准教授 (00579667)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2025年度: 520千円 (直接経費: 400千円、間接経費: 120千円)
2024年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2023年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
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| キーワード | MAM / ミトコンドリア / オルガネラ間接触 / CLEM / コンタクトサイト |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞内ではミトコンドリアと小胞体が頻繁に接触している。近年この接触場に様々な分子が集まり、代謝障害など病気にも関係することが指摘されている。現在この接触場を光学顕微鏡で可視化する方法がいくつも開発され、これにより細胞機能との関連が評価されている。しかし、光学顕微鏡で捉えた機能的な接触場が、はたして電子顕微鏡レベルでどのような姿なのかは十分評価されていない。我々はこれまでに、光学顕微鏡で観察した場所そのものを同じ試料上で電子顕微鏡観察し、三次元的に比較検討できる3D-CLEMという新しい技術を開発してきた。本研究は、この技術を使い光学顕微鏡的に検出される接触場の本当の姿を明らかにするものである。
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| 研究実績の概要 |
ミトコンドリア小胞体接触領域（Mitochondria-associated membrane; MAM）は、ミトコンドリア外膜上にシグナル分子が集積する特異な膜ドメインとして、生理学的機能や疾患との関連から注目されている。これまで、光学顕微鏡レベルでMAMを検出・解析するために、split-GFP、NanoBiT、近接ライゲーションアッセイ（PLA）など複数のレポーターが開発されてきたが、これらが電子顕微鏡（EM）レベルでどのような構造と相関するかは明らかでない。本研究では、三次元光学-電子相関顕微鏡（3D-CLEM）を用いて、これらのレポーターで観察されたMAMが、電子顕微鏡的にどのような構造に対応するのかを同一試料上で解析し、MAMの構造的多様性と機能的意義との関連を明らかにすることを目的とした。
今年度は、上述の3種のレポーターによるMAM検出の再評価を行い、その一部について3D-in resin CLEMによる構造解析を実施した。特に、MAM研究で広く用いられるPLA法では、IP3RとVDAC間の近接を検出することでMAMの可視化が可能とされている。HeLa細胞およびMEF細胞を用いて既報に準じた条件で実施した結果、同様の蛍光シグナルを確認したが、同一試料を用いた3D-CLEM観察では、MAM構造が存在しない領域にも多数の近接シグナルが検出されることが明らかとなった。
この結果は、MAM検出に用いられるレポーターの中には、使用法や解釈に注意を要するものがあることを示唆しており、今後の解析にはEMとの相関観察が不可欠であることを示している。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
本課題における中核技術であるArray Tomographyを用いた三次元相関顕微鏡（3D-CLEM）については、実際の生物試料を用いた解析により、構造評価が可能な画像データを得ることができ、その一部は学会報告を行った。これにより、本手法が本研究対象に対して有効に機能することを確認できた。
一方、免疫組織化学的CLEMを用いたMAMの可視化については、検討した抗体の一部のラベリング結果が期待されるMAM構造を十分に反映していない可能性が示唆されており、これらの結果を踏まえて、今後は抗体等の再検討・改善を行う予定である。
３DデータのAI解析については、ステップワイズ学習法を基盤とした画像分類モデルの構築を行い、条件の異なる画像群に対しても同一の識別モデルにより比較検討が可能となる運用手順を確立した。現在、本モデルを用いた解析が実際に稼働しており、今後の構造評価の効率化・標準化に資することが期待される。
以上の点を踏まえ、現時点では各技術項目において概ね順調に進捗していると判断している。引き続き、得られた結果に基づいた手法の最適化と実証を進め、MAM構造の多様性と機能的意義に関する包括的理解の構築を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、免疫組織化学的検出およびPLA（Proximity Ligation Assay）によるMAM検出については、より精密な位置情報の取得が可能なin-resin CLEM法を適用し、新たに導入した色素を用いたプロトコールで実証を進めている。一部のレポーター系（例：split-GFP等）では、これらの新規色素との併用が技術的に困難であるため、従来法を用いた解析を継続する方針である。
免疫組織化学的検出法については、これまでの検証において、明らかにMAM構造とは一致しないシグナル分布が観察されるケースが確認されており、これらについてはCLEM解析を行わず、有望なレポーターのみを選択的に対象として詳細な解析を進める予定である。
今年度前半までに各検出法に基づく画像データの取得と初期解析を完了させることを目標とし、後半にかけて得られた知見をもとに学会発表および論文作成へと進める計画である。これに向けて、現在各手法の再現性・信頼性の検証および必要な条件検討を含めて進めている。
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