| 研究課題/領域番号 |
23K06451
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分49020:人体病理学関連
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
本田 一穂 昭和大学, 医学部, 教授 (10256505)
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| 研究分担者 |
高木 孝士 昭和大学, 大学共同利用機関等の部局等, 准教授 (10774820)
康 徳東 昭和大学, 医学部, 講師 (00571952)
澤 智華 昭和大学, 医学部, 講師 (80422541)
鈴木 泰平 昭和大学, 医学部, 准教授 (10749948)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2025年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | ３次元電子顕微鏡 / 走査型電子顕微鏡 / アレイトモグラフィー法 / 腎糸球体傷害 / 分子標的薬 / 糸球体傷害 / オルガネラ / 血栓性微小血管症 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究はがん治療に用いられている分子標的薬による糸球体傷害の腎生検材料を用いて，最新の手法である3次元電子顕微鏡解析を応用し，糸球体細胞の超微形態変化，特に細胞小器官（オルガネラ）の異常を明らかにし，病態診断と治療への糸口を探る。さらに糸球体マイクロダイセクションによる蛋白質量分析で，オルガネラ異常関連蛋白を同定し，分子標的薬による糸球体傷害の機序の解明とバイオマーカーの探索に役立てたい。3次元電子顕微鏡法を駆使したオルガネラ診断法の確立は，ミトコンドリア病やライソゾーム病など多くの難治性疾患の新たな診断のみならず，各種疾患の病態診断に役立つことが期待される。
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| 研究実績の概要 |
令和６年度は、分子標的薬による腎障害の立体構造解析に向けて、3次元電子顕微鏡観察法の技術基盤となる「連続超薄切切片標本の作製法（アレイトモグラフィー法）」の検討を優先的に実施した。昨年実施したヒト胎盤絨毛組織に加えて、マウス腎組織を用いた。試料はエポン樹脂包埋を施し、専用の新規開発超薄切用器具を用いて連続超薄切片を作成、基板上に整列アレイ状に貼付した。アレイトモグラフィー法の学内実施が可能な基盤が確立できた。本研究は、分子標的薬による腎障害のうち、従来の光学的観察では捉えきれなかった血管内皮細胞の微細構造変化を3次元的に可視化することで、新たな病態分類や診断マーカーの創出に資するものである。装置の本格稼働と症例の解析が進めば、希少かつ重要な腎障害メカニズムの解明につながることが期待される。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
3: やや遅れている
理由
本年度は、分子標的薬による腎障害の立体的評価を目的とした3次元電子顕微鏡解析に向けて、観察技術の基盤構築をさらに進展させた。特に、連続超薄切切片標本を用いたアレイトモグラフィー法の技術的検討を、昨年度のヒト胎盤絨毛組織に加え、新たにマウス腎臓組織を対象として実施し、より本研究の目的に即したモデルでの試行を行った。
試料はエポン樹脂で包埋後、新規開発された専用の超薄切用器具を用いて連続超薄切片を作製し、整列アレイとして基板上に貼付する一連の工程を学内で確立。これにより、アレイトモグラフィー法の学内実施体制の確立に成功した。一方、令和6年度初頭に導入された高機能走査型電子顕微鏡（日立SU8600）については、予定通り4月に装置が納入されたものの、5月から8月にかけての使用研修と調整作業に時間を要したため、本格的な撮像開始には至らなかった。これにより、学内での連続切片撮影は未実施となっており、今年度の解析については、昨年度同様、学外の電子顕微鏡施設を借用して進める必要があった。
また、研究対象となる分子標的薬による腎障害症例の選定作業はすでに完了し、研究協力施設（腎臓内科・病理部門）との事前打ち合わせも終えている。中でも、腎障害のうち糸球体レベルの血管内皮障害に焦点を当てた解析計画を策定しており、現在はそれに基づいた倫理申請書の作成を進行中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和7年度は、以下の計画で研究の本格的展開を図る。
１．症例選定と倫理審査の完了：選定済みの分子標的薬による腎障害症例の薬剤投与歴と腎機能障害の発症時期・病理学的特徴の関連性を確認し、学内外の倫理審査委員会の承認を得る。
2. 病理組織の精査と対象症例の選抜：光学顕微鏡、蛍光顕微鏡によるスクリーニング観察を実施し、特に糸球体内皮細胞の腫大、内皮下沈着物、内皮細胞の退縮といった血管内皮傷害を呈する症例を選定する。
3. 連続超薄切片による3次元構造解析の実施：選定症例のTEM用エポン包埋ブロックを用いて、アレイトモグラフィー法による連続超薄切片を作成し、日立SU8600を用いて高解像度・連続的なSEM撮像を実施する。これにより、糸球体血管構造の微細な変化、特に内皮細胞・基底膜・上皮細胞の三者間構造を立体的に解析する。
4. 画像解析と定量評価：得られたSEM画像はPhotoshop（Adobe Inc.）およびDragonFly（Maxnet）を用いて、3次元的再構築、断面毎の定量評価（血管内腔径、内皮細胞厚、フィロポディア構造の出現など）を実施し、病態分類の新たな指標として活用する。
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