細菌刺激によるプロテアソームを介したプレセプシン産生機序の解明

研究課題

研究課題/領域番号	23K06534
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分49050:細菌学関連
研究機関	神戸常盤大学
研究代表者	溝越祐志神戸常盤大学, 保健科学部, 講師 (50736163)
研究分担者	澤村暢神戸常盤大学, 保健科学部, 講師 (20709042) 鈴木高史神戸常盤大学, 保健科学部, 教授 (70305530)
研究期間 (年度)	2023-04-01 – 2027-03-31
研究課題ステータス	交付 (2024年度)
配分額 *注記	4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円) 2026年度: 130千円 (直接経費: 100千円、間接経費: 30千円) 2025年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円) 2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円) 2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
キーワード	プレセプシン / プロテアソーム / ユビキチン / エンドサイトーシス / CD14 / クラスリン / カベオリン / 敗血症 / 免疫応答 / マクロファージ
研究開始時の研究の概要	敗血症は世界規模で罹患率、死亡数が多い疾患である。本邦では敗血症の診断マーカーとしてプレセプシンが保険適用されているが、その産生機序の詳細は解明されていない。本研究は細胞内に存在するプロテアソームと呼ばれる複合体に着目して、プレセプシンがどのように産生されるかを解明する。本研究により、臨床における敗血症とプレセプシン値推移の適正な解釈・理解につながるだけでなく、敗血症時のプロテアソームを介した免疫細胞の新たな応答シグナルの発見および敗血症治療への応用も期待できる。
研究実績の概要	本研究は、「プレセプシン」の産生機序および新規CD14細胞内トラフィッキングの解明を目的としており、以下の3項目の遂行を目標としている。1.プレセプシン産生に関わる細胞内因子の特定　― プレセプシンの前駆体であるCD14の切断機構を明らかにする。2.CD14分子の細胞内トラフィッキングの詳細な解明　― CD14がどの経路を経て細胞内に取り込まれ、切断に至るのかを明らかにする。3.プレセプシン産生におけるCD14細胞内トラフィッキングの意義の解明 2024年度は、上記のうち「1. プレセプシン産生に関わる細胞内因子の特定」に重点を置いて研究を進めた。プレセプシン前駆体であるCD14の切断機構の解明を目指し、初代ヒトマクロファージを用いた実験系に加えて、マクロファージ様細胞株であるU-937細胞を用いたプレセプシン産生系を新たに確立した。 U-937細胞およびヒト単球由来マクロファージに対して、阻害剤処理、遺伝子ノックダウン、ノックアウト法を用いた解析を行った結果、プロテアソームを構成するサブユニットであるβ5（PSMB5）およびβ5i（PSMB8）のプロテアーゼ活性が、CD14の切断およびプレセプシンの産生に関与していることを明らかにした。また、CD14がどのように細胞内へ取り込まれ、プロテアソームに至るかを解明するため、細胞内トラフィッキングに関与する分子の探索を行った。その結果、クラスリンおよびカベオリン１がプレセプシン産生に関与すること、さらにユビキチン化に関与する分子のうちユビキチンAがプレセプシンの産生に関わる可能性が示唆された。
現在までの達成度	現在までの達成度 3: やや遅れている理由目的1である「プレセプシン産生に関わる細胞内因子の特定」に関する検討において、初年度に計画の遅れが生じたため、今年度は目的2である「CD14分子の細胞内トラフィッキングの詳細な解明」に関しては、関与因子の探索にとどまり、詳細なメカニズムの解明には至っていない。
今後の研究の推進方策	今後の研究の推進にあたっては、プレセプシン産生に関与する分子の探索およびその分子メカニズムの解明をより効率的に進めるため、効率的な遺伝子ノックインおよびTet-on/off制御システムをゲノムに導入したU-937細胞の樹立を目指す。この確立した細胞系を用いて、遺伝子ノックアウト・ノックイン実験を行い、これまでの探索で候補として挙がった分子の発現制御を行うことで、プレセプシン産生への影響を検証する。これにより、CD14分子の細胞内トラフィッキングの詳細な解明と、その生理的意義の明確化を図る予定である。