| 研究課題/領域番号 |
23K06670
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 配分区分 | 基金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
小区分50010:腫瘍生物学関連
|
|---|
| 研究機関 | 東京科学大学 (2024)
東京医科歯科大学 (2023) |
|---|
研究代表者 |
辻岡 政経 東京科学大学, 総合研究院, プロジェクト講師 (60442985)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
|
| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2025年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
|
|---|
| キーワード | FAP1 / FRNK / FAK / がん / 接着斑 / DNA損傷ストレス / ケミカルバイオロジー |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
申請者は、新たに発見した接着斑構成タンパク質FAP1 が、がんの生着や播種に関与し、がんの悪性化を促進することを見出している。本研究では、①FAP1 の発現制御機構とその機能、②生体での役割を明らかにするとともに、③がんの生着に関わるメカニズムを明らかにする。また、④ケミカルバイオロジーを応用して、FAP1 関連分子の同定と、これらを標的とした抗がん剤候補化合物の開発を行う。
|
| 研究実績の概要 |
がん細胞は、周囲の細胞外マトリックスと接着することにより移動し、浸潤、転移を行う。細胞の接着は、接着分子であるインテグリンと、その細胞質側に集積する多様なタンパク質からなる接着斑が担う。申請者は、接着斑構成タンパク質FAP1が、がんの悪性化を促進することを見出した。①FAP1の欠損により、がん細胞の生体への生着、播種が著しく抑制されることに加え、②FAP1は、DNA損傷ストレスにより発現が誘導され、FAP1を発現する腫瘍塊中の細胞ではDNA損傷が検出されること、③FAP1により接着斑が安定化し、細胞接着が増強されること、④FAP1の強制発現により、がん細胞の浸潤能が上がること、⑤大腸がんの臨床検体では、その30%程度にFAP1の発現が検出されること、を本申請以前に明らかにしている。これらの結果から、腫瘍塊中では、DNA損傷によりFAP1が発現して細胞接着を増強し、がんの生着・転移、ひいては悪性化を促進する、という仮説を構築している。本研究の目的は、この仮説を基に、FAP1の機能と発現制御機構、がん悪性化における役割を明らかにすることである。
FAP1は、既知のタンパク質FRNKと同一であることを明らかにした。FRNKは、接着斑の主要タンパク質であるFAKの、中央ややC末寄りに存在するメチオニンを開始コドンとしたタンパク質である。このため、FRNKは、FAKのN末ドメインやキナーゼドメインは有していないものの、このメチオニン以降のFAKと同一のアミノ酸配列を持ち、C末端に存在する接着斑局在ドメインも同一である。また、開始メチオニンを含むエキソンの上流にFRNKの発現制御領域があるが、これはFAKのイントロン領域に該当する。この制御領域を破壊することにより、FAKの発現には影響せず、FRNKのみが欠失する細胞株が得られている。
|
| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
当該年度は、がん細胞を用いたFRNKの解析に注力し、以下のように、一定の進展が得られた。
肝臓がん細胞株DLD1は、DNA損傷剤であるエトポシドでの処理により、FRNKタンパク質の発現が誘導され、通常培養下でもFRNKを強制発現させると浸潤能が上がることを本申請以前に明らかにしていた。エトポシドで細胞を処理すると、過剰なダメージのために細胞死を起こすなど、その後の解析が困難であった。がん細胞は、通常培養下でもその増殖速度やゲノムの不安定性から一定のDNAストレスを受けていることから、当該年度は、通常培養下のDLD1細胞を用いたFRNKの解析を試みた。エトポシド無処理の状態では、ウェスタンブロットによるFRNKタンパク質の検出は困難であったものの、FRNK遺伝子の発現は、RT-PCRにより検出された。そこで、FRNK特異的抗体を用いた免疫染色を試みると、接着斑様の局在が確認された。抗FAK抗体との二重染色を行い、詳細に観察すると、同じ接着斑の中でも、FAKは、より先端に多く局在しており、FRNKはより根元側に多く、接着斑における両者の機能の違いが示唆された。
さらに、当該年度は、より多くのがん細胞株を用いて、FRNKタンパク質の発現を調べた。本申請以前に、大腸がん臨床検体の約30%において、FRNK遺伝子の発現が検出されていたため、FRNKを発現するための特性の理解を当初からの目標としている。15種類のがん細胞株を用いたウェスタンブロット解析により、FRNKタンパク質の発現を調べたところ、卵巣がん、肺がん、大腸がんのそれぞれ１種類の細胞株では、通常培養の状況下で、明確なFRNKのバンドが検出された。これまで、人為的にDNA損傷を与えることなく、明確なFRNK発現を検出できる細胞は得られていなかったので、FRNKの機能と発現制御機構を明らかにするために適した細胞株が得られた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
当該年度は、15種類のがん細胞株を新たに用いて、FRNKを強く発現する細胞を3株見出した。今後は、解析する細胞株をさらに40種類程度まで増やして、FRNKの発現を調べ、FRNK発現に関わる特性を明らかにする。具体的には、組織特異性、染色体の異数性、p53の変異の有無、各種がん関連遺伝子の発現レベル等を解析し、FRNK発現に関わるがんの属性を明らかにする。また、これらのがん細胞を用いてマウスへの移植実験を行い、FRNKの有無とがん悪性化の程度や転移のパターン、既存の抗がん剤の効果に違いがあるかを調べ、FRNKを発現するがんの特徴を明らかにする。この際、FRNKを発現するがん組織においては、FRNK発現の時空間的パターンを解析し、がん組織中でどのようにFRNKの発現が誘導され、どのようにがんの成長、転移を促進するのかを検討する。
さらに、当該年度は、接着斑中でのFAKとFRNKの局在の違いを見出したので、integrin、talin、paxillinなど、他の接着斑因子の局在の詳細も観察する。FRNKと同様の局在を示す接着斑因子を明らかにし、それらの機能とFRNKとの関わりを、培養細胞、in vitroで作製したがん細胞塊、移植したin vivoのがん細胞を駆使して明らかにし、FRNKの関わるがん悪性化機構を検討する。
また、FRNKによる接着斑の生理的機能を明らかにするため、前年度までにcreリコンビナーゼの作用によりFAKの代わりにFRNKを発現するように設計したマウスを作製した。しかし、このマウスは生まれてこないため、胎生致死となっている可能性が考えられる。どの発生段階で、どのような理由で致死に至るのかを解析する。
|
