マルチ核酸リキッドバイオプシーによる膵癌の超早期診断

• 研究課題/領域番号: 23K06759
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分50020:腫瘍診断および治療学関連
• 研究機関: 医療法人徳洲会札幌東徳洲会病院医学研究所
• 研究代表者: 小野 裕介 医療法人徳洲会札幌東徳洲会病院医学研究所, ゲノム診断研究部, 部門長 (40742648)
• 研究分担者: 高橋 賢治 旭川医科大学, 大学病院, 助教 (00736332) ; 水上 裕輔 旭川医科大学, 医学部, 教授 (30400089)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円); 2025年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2024年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円); 2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
• キーワード: 早期診断 / リキッドバイオプシー / 遊離核酸 / 膵癌 / IPMN / ドライバー変異 / ゲノム編集 / バイオマーカー / 遊離RNA

研究開始時の研究の概要

分子サブタイプに基づく精密医療の導入において、疾患特異的なRNA発現プロファイルは腫瘍の悪性化に向かう直接の発現経路の変化に応じたバイオマーカーになり得ると考えられる。本研究では膵癌の中でも早期に治癒切除可能な膵管内乳頭粘液性腫瘍 (IPMN) におけるドライバー遺伝子変異の蓄積パターンに伴う転写経路の変化を統合的に評価する診断系の基盤作りを目指す。高度に断片化された体液中の遊離RNAの安定的な検出系の構築とゲノム編集細胞株を用いたIPMN特異的なドライバー遺伝子KRAS、GNAS変異による遺伝子プロファイルの解析データを基盤として、患者由来の体液サンプルにおける発現経路変動の検出を行う。

研究実績の概要

ゲノム編集細胞株の取得と解析についてHPDE株およびhTERT-HPNE株にKRAS G12D変異およびGNASR201HまたはR201C変異を導入し、複数クローンのゲノム編集株を取得した。これらの細胞株間で遺伝子変異による生育速度や形態に差は見られなかった。これらの細胞株についてのRNA-seqによる発現比較の結果、GNAS変異が導入されることによりKRAS変異による発現プロファイルの変動が抑制される発現プロファイルデータを得た。
また、遊離RNA単離と検出として、培養上清および患者血漿からcfRNAを抽出し収量と安定性について、高収量を得られる系を構築した。ターゲット遺伝子を選定し、デジタルPCRで検出した。本解析系では200bp以下の短い断片が検出しやすいことが判明した。健常者血漿ではRNAの99%がrRNAであり、mRNA検出にはrRNA除去が必要と考えられた。現在、更なる高感度の検出を目指し、12サイクルのpre-amplificationによるRNAの増幅、また高度に分解していると考えられる50 bp程度の断片化RNAを効率よく捕捉できる磁気ビーズを用いた抽出条件を検討している
さらに、検体を用いたバイオマーカー候補の評価としてIPMN患者および健常者の保存血漿を用い、方法2で確立した手法でcfRNAを抽出し、候補RNAの発現量を比較した結果、比較検討に十分な量が得られなかった。一方で、膵消化液である膵液を材料とした場合、cfRNAの収量は血漿と比較しても大きくデジタルPCRによりより効率に検出可能であったことより、血液に加え消化液についての検証も現在行っている。

現在までの達成度

3: やや遅れている

理由

昨年までに作製したゲノム編集株について、細胞親株に問題がありゲノム編集株の再取得を目指していた。また、研究実績にも一部記載したがデジタルPCRのRNAの検出量が小さく発現比較検討が困難な遺伝子が多いため、収量を高める系の再検討を行うと共にターゲット遺伝子の候補の再選定を試みている。

今後の研究の推進方策

遊離RNAにおけるデジタルPCRを進めると共に、もうひとつの核酸バイオマーカーとしてIPMNに特異的に検出できるDNAのメチル化の変化について追跡することを検討する。膵癌マーカーとしてのメチル化については報告も多いものの、本研究の背景であるIPMN特有のメチル化ターゲットについての探索については報告が少なく、IPMNの分子プロファイルの変化の違いによる癌化・予後予測に関与するターゲットの探索と、遊離DNAにおける検出系の構築については本研究課題で目指す目的の範囲内と考えられるため、発現プロファイルの変化を捉えるといった当初の目的を補完する項目として進めていく。

研究成果

• [雑誌論文] Highly multiplexed digital PCR assay for simultaneous quantification of variant allele frequencies and copy number alterations of KRAS and GNAS in pancreatic cancer precursors (2025)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Junko、Nakagawa Tatsuo、Ono Yusuke、Kamura Yoshio、Ishida Takeshi、Kawabata Hidemasa、Takahashi Kenji、Sato Hiroki、Liss Andrew S.、Mizukami Yusuke、Yokoi Takahide
  • 雑誌名: Molecular Oncology 巻: 掲載準備中 号: 10 ページ: 2921-2935
  • DOI: 10.1002/1878-0261.70011
• [雑誌論文] Three Molecular Developmental Pathways of Remnant Pancreatic Cancer after Resection (2024)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Shuji、Omori Yuko、Ono Yusuke、Hirose Katsuya、Itoh Taito、Yamaue Hiroki
  • 雑誌名: Annals of Surgery 巻: ー 号: 6 ページ: 1015-1025
  • DOI: 10.1097/sla.0000000000006444
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Liquid Biopsy for Pancreatic Cancer by Serum Extracellular Vesicle-Encapsulated Long Noncoding RNA HEVEPA. (2024)
  • 著者名/発表者名: Takahashi K, Inuzuka T, Shimizu Y, Sawamoto K, Taniue K, Ono Y, Asai F, Koyama K, Sato H, Kawabata H, Iwamoto H, Yamakita K, Kitano Y, Teramoto T, Fujiya M, Fujii S, Mizukami Y, Okumura T.
  • 雑誌名: Pancreas. 巻: - 号: 5 ページ: 395-404
  • DOI: 10.1097/mpa.0000000000002315
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Gene Rearrangement and Expression of PRKACA and PRKACB Govern Morphobiology of Pancreatobiliary Oncocytic Neoplasms (2024)
  • 著者名/発表者名: Itoh T, Omori Y, Seino M, Hirose K, Date F, Ono Y, Mizukami Y, Aoki S, Ishida M, Mizuma M, Morikawa T, Higuchi R, Honda G, Okamura Y, Kinoshita K, Unno M, Furukawa T.
  • 雑誌名: Modern Pathology 巻: 37 号: 1 ページ: 100358-100358
  • DOI: 10.1016/j.modpat.2023.100358
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Local recurrence after successful endoscopic submucosal dissection for rectal mucinous mucosal adenocarcinoma: A case report (2023)
  • 著者名/発表者名: Murakami Yuki、Tanabe Hiroki、Ono Yusuke、Sugiyama Yuya、Kobayashi Yu、Kunogi Takehito、Sasaki Takahiro、Takahashi Keitaro、Ando Katsuyoshi、Ueno Nobuhiro、Kashima Shin、Yuzawa Sayaka、Moriichi Kentaro、Mizukami Yusuke、Fujiya Mikihiro、Okumura Toshikatsu
  • 雑誌名: World Journal of Gastrointestinal Oncology 巻: 15 号: 1 ページ: 186-194
  • DOI: 10.4251/wjgo.v15.i1.186
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Monitoring mutant KRAS in plasma cell-free DNA can predict disease progression in a patient with multiple myeloma: A case report (2023)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto Masayo、Shindo Motohiro、Funayama Takuya、Sumi Chihiro、Saito Takeshi、Toki Yasumichi、Hatayama Mayumi、Ono Yusuke、Sato Kazuya、Mizukami Yusuke、Okumura Toshikatsu
  • 雑誌名: Clinica Chimica Acta 巻: 551 ページ: 117590-117590
  • DOI: 10.1016/j.cca.2023.117590
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two Cases of SMARCA4-Deficient Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) with Improved Performance Status (PS) after Treatment with Immune Checkpoint Inhibitors (ICIs) (2023)
  • 著者名/発表者名: Koizumi Akiko、Tamura Yukiho、Yoshida Ryohei、Mori Chie、Ono Yusuke、Tanino Mishie、Mizukami Yusuke、Sasaki Takaaki
  • 雑誌名: Cureus 巻: 15
  • DOI: 10.7759/cureus.37656
  • 査読あり
• [雑誌論文] Low-grade papillary Schneiderian carcinoma with TP53 mutation: a case report and review of the literature (2023)
  • 著者名/発表者名: Yuzawa Sayaka、Michizuka Tomohiko、Kakisaka Rika、Ono Yusuke、Hayashi Manami、Takahara Miki、Katada Akihiro、Mizukami Yusuke、Tanino Mishie
  • 雑誌名: Diagnostic Pathology 巻: 18 号: 1 ページ: 13-13
  • DOI: 10.1186/s13000-023-01334-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular comparison of concurrent components of high-grade dysplasia, adenocarcinoma, and sarcomatoid carcinoma in a case of sarcomatoid carcinoma of the gallbladder (2023)
  • 著者名/発表者名: Hirose Katsuya、Omori Yuko、Ono Yusuke、Mizukami Yusuke、Kaneko Yoshiki、Maruyama Tsunehiko、Ohtani Haruo、Furukawa Toru
  • 雑誌名: Virchows Archiv 巻: 99 号: 2 ページ: 99-99
  • DOI: 10.1007/s00428-023-03524-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Multiplex Digital PCR Assay to Detect Multiple KRAS and GNAS Mutations Associated with Pancreatic Carcinogenesis from Minimal Specimen Amounts (2023)
  • 著者名/発表者名: Maeda Chiho、Ono Yusuke、Hayashi Akihiro、Takahashi Kenji、Taniue Kenzui、Kakisaka Rika、Mori Miyuki、Ishii Takahiro、Sato Hiroki、Okada Tetsuhiro、Kawabata Hidemasa、Goto Takuma、Tamamura Nobue、Omori Yuko、Takahashi Kuniyuki、Katanuma Akio、Karasaki Hidenori、Liss Andrew Scott、Mizukami Yusuke
  • 雑誌名: The Journal of Molecular Diagnostics 巻: 23 号: 6 ページ: 1525-1578
  • DOI: 10.1016/j.jmoldx.2023.02.007
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] GATA6 and CK5 Stratify the Survival of Patients With Pancreatic Cancer Undergoing Neoadjuvant Chemotherapy (2023)
  • 著者名/発表者名: Kokumai Takashi、Omori Yuko、Ishida Masaharu、Ohtsuka Hideo、Mizuma Masamichi、Nakagawa Kei、Maeda Chiho、Ono Yusuke、Mizukami Yusuke、Miura Shin、Kume Kiyoshi、Masamune Atsushi、Morikawa Takanori、Unno Michiaki、Furukawa Toru
  • 雑誌名: Modern Pathology 巻: 36 号: 5 ページ: 100102-100102
  • DOI: 10.1016/j.modpat.2023.100102
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Serine/Threonine Kinase 11 Plays a Canonical Role in Malignant Progression of KRAS-mutant and GNAS-wild-type Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms of the Pancreas (2021)
  • 著者名/発表者名: Omori Yuko、Ono Yusuke、Morikawa Takanori、Motoi Fuyuhiko、Higuchi Ryota、Yamamoto Masakazu、Hayakawa Yuko、Karasaki Hidenori、Mizukami Yusuke、Unno Michiaki、Furukawa Toru
  • 雑誌名: Annals of Surgery 巻: Publish Ahead of Print 号: 2 ページ: e384-e395
  • DOI: 10.1097/sla.0000000000004842
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Liquid Biopsy targeted for measurement of long non-coding RNA expression combined with mutation profiles in pancreatic juice from pancreatic adenocarcinoma (2024)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Ono, Kenji Takahashi, Yohei Takeda, Taro Yamashita, Yuri Sakamoto, Chiho Maeda, Mayumi Suzuki, Hajime Isomoto, Yusuke Mizukami
  • 学会等名: American Pancreatic Association annual meeting 2024
  • 国際学会
• [学会発表] High-sensitive liquid biopsy using pancreatic juice/duodenal fluid containing tumor-derived DNA to capture genetic mutations by molecular barcode sequencing (2023)
  • 著者名/発表者名: Ono Y, Takahashi K, Maeda C, Hayashi A, Kawabata H, Okada T, Sato H, Saito A, Kawamoto T, Takahashi K, Kimura K, Iwano H, Yanagawa N, Suzuki M, Mori M, Karasaki H, Mizukami Y
  • 学会等名: 31st UEG week 2023; Abstract Session "New insights into pancreatic diseases: From inflammation to cancer"
  • 国際学会
• [備考] 札幌東徳洲会病院 医学研究所 研究業績 2023年度
  • URL: http://www.higashi-tokushukai.or.jp/inst_biomed_res/achievement/2023/
• [備考] 代表者所属 札幌東徳洲会病院 医学研究所 ゲノム診断研究部 研究内容
  • URL: http://www.higashi-tokushukai.or.jp/inst_biomed_res/details/post_7.html
• [備考] 分担者（水上・高橋）所属 旭川医科大学 内科学講座
  • URL: https://amu-imed.jp