| 研究課題/領域番号 |
23K07134
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分52040:放射線科学関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
山崎 憲政 広島大学, 技術センター, 技術主任 (70564136)
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| 研究分担者 |
岩田 哲郎 東京科学大学, 生命理工学院, 助教 (30771563)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2025年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | 枯草菌ゲノムベクター / ゲノム再構築 / T 細胞受容体 / ゲノム編集 / ノックインマウス / 免疫系ヒト化マウス / T細胞受容体 / 枯草菌ベクター |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ヒト免疫関連疾患で、特徴的なT細胞受容体 (TCR) パターンを示すT細胞が出現することが明らかにされつつある。本研究では、それらの病態機能解明に役立つ新たな免疫系ヒト化マウスを開発する。枯草菌ゲノムを利用したベクター技術とゲノム編集技術を融合し、ヒトTCRゲノムのKIマウスを作出する。各種疾患に関連したヒト主要組織適合抗原複合体のKIマウスも作出し、マウス体内にヒト型抗原認識系の完全構築を図る。ヒト疾病発症の起点となるT細胞の誕生から病態形成、TCRレパトア変化に至る過程を解析できることに加え、種々免疫関連疾患の病態解明に向けた研究基盤構築ならびに放射線科学の発展に貢献する。
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| 研究実績の概要 |
ヒトTCRノックインマウスの作出のため、ヒトTCR領域をカバーするBACクローンを枯草菌ゲノムベクター上で逐次連結させ、ヒトTCR遺伝子座の再構築を進めている。β鎖ゲノム領域について、全体をひとまず枯草菌ゲノムベクター上へ導入してから再構築する戦略に変更し、４つのセクションを枯草菌ベクター上に構築した（190, 330, 300, 170 kb）。これらの再構築を進めて、現在は前半および後半をそれぞれカバーする２つのセクション（430, 360 kb）の連結操作の確認を進めている。枯草菌ベクターからの回収操作については、回収効率を上げるため枯草菌ゲノム分断法を利用する遺伝子カセットについて、まず昨年度検討したカセットの改良をおこなった。HLA-KIマウスについては、Cre/loxPおよびその類縁システムを利用し、任意のHLAを簡便に挿入できるシステム構築を目指している。マウスMHC領域の両端に組換え酵素認識配列を挿入する作業をi-GONAD法で進め、少なくとも１箇所の配列挿入を完了した。このマウス授精卵にHLA組換えドナーベクター、Creリコンビナーゼ発現ベクターを共移入し、HLAが導入できるかどうか確認する、現在ベクターを調製中である。Cre/loxPおよびその類縁システムは、枯草菌ベクターに再構築したヒトTCRをノックインする際にも活用できる可能性があることから、マウスTCR領域の両端に組換え酵素認識配列を挿入する作業も開始した。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
3: やや遅れている
理由
ヒトゲノム領域の再構築状況について、α鎖ゲノム領域は、４つのBACクローンの連結によってクラスターの上流側から約500 kb領域の再構築まで、β鎖ゲノム領域は、末端BACクローンの導入に時間を要したため、戦略を一部変更し、内部のクローン同士の再構築と両端クローン枯草菌ベクターへの導入を経て、現在前半および後半をそれぞれカバーする２断片（430, 360 kb）の確認をおこなっている。枯草菌ベクターからTCR断片を回収する方策については、ゲノムベクターとの分離効率と、直鎖状よりも機械的ダメージを受けにくいことが期待できる環状DNAで回収できる点から、枯草菌ゲノム分断法を利用する遺伝子カセットを構築して枯草菌ベクターへ導入した。再構築した約360 kbのα鎖ゲノム断片を用いた予備実験においては、BGMベクターからインサートを分断した後、大量精製するまでの間にインサートが脱落する懸念が生じている。
HLA-KIマウス作成について、当初HLA-DRA-cDNAをi-GONAD法により導入することを試みたが、目的マウスが容易に得られなかった。多様なHLAを挿入したマウスをラインアップすることを目指していることから、より簡便に挿入できるシステムを構築する必要があると考え、Cre/loxPおよびその類縁システムを活用する方針に変更した。i-GONAD法で酵素認識配列挿入作業を進め、目的個体が得られつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒトα鎖およびβ鎖ゲノム領域の再構築ができていないクローンについて、枯草菌ベクター上での再構築を継続する。β鎖ゲノム領域については、全長を２断片に分けた再構築ゲノム断片が先に完成することが見込まれるため、以下の方法でインサートの回収を試み、ヒトβ鎖ノックインマウス作出のためマウス細胞への導入を検討する。枯草菌ベクターからの回収法については、培養条件や枯草菌からのDNA抽出、超遠心精製方法について、まずは500 kbまでの再構築断片に対してマウス細胞への導入できるグレード（インタクトかつ高純度）で十分な収量が得られる精製プロトコルを確立する。精製したゲノム断片を用いてエレクトロポレーションとCRISPR-Cas9により、ノックインマウス作出のためES細胞への導入を試みる。
HLA-KIマウス作成については、Cre/loxPおよびその類縁システムを用い、マウスMHC領域の両端に組換え酵素認識配列を挿入する作業を継続する。得られたマウスより受精卵を採取し、各種疾患関連 HLA を組み込んだドナーベクターとリコンビナーゼの共注入により、 目的とするHLA の導入を確認する計画である。作出した免疫系ヒト化マウスを用い、T細胞の抗原応答性やヒト免疫関連疾患における病態解析モデルとしての有用性を確認する。
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