リポソームを捕捉したマクロファージのMDSC様細胞への変容に関わる分子基盤の解明

研究課題

研究課題/領域番号	23K07243
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分52050:胎児医学および小児成育学関連
研究機関	旭川医科大学
研究代表者	吉田陽一郎旭川医科大学, 医学部, 客員助教 (80750306)
研究分担者	東寛旭川医科大学, 医学部, 名誉教授 (00167909) 佐藤雅之旭川医科大学, 医学部, 助教 (00624181) 甲賀大輔旭川医科大学, 医学部, 准教授 (30467071) 長森恒久旭川医科大学, 医学部, 講師 (40400098) 青山藍子旭川医科大学, 大学病院, 医員 (60596295) 酒井宏水奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (70318830) 石羽澤映美旭川医科大学, 大学病院, 病院助教 (90516402)
研究期間 (年度)	2023-04-01 – 2026-03-31
研究課題ステータス	交付 (2024年度)
配分額 *注記	4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円) 2025年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円) 2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円) 2023年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
キーワード	リポソーム / マクロファージ / 小胞体ストレス / NF-kB / iNOS / 免疫チェックポイント分子 / MDSC
研究開始時の研究の概要	脂質二十膜小胞体（リポソーム）は多くの薬剤の担体として使用されている。我々はこのリポソームが生体内でマクロファージに取り込まれることで軽微な免疫修飾作用を起こすことを見ており、この研究では主にそのメカニズムを明らかにする。具体的には、細胞外に分泌されるサイトカインや修飾される細胞内シグナル伝達の同定、また細胞小器官を含む細胞形態の変化の描出などを行う。予備実験から持つ仮説として、とりこまれた脂質二十膜の長鎖脂肪酸などの成分がマクロファージ内の小胞体ストレスを惹起し、免疫チェックポイント分子の発現を修飾する可能性を考えており、実証した際に臨床的応用の可能性につながる可能性がある。
研究実績の概要	A)リポソーム捕捉マクロファージの表現型解析 RAW264.7細胞にリポソームを添加した際に、まず細胞内シグナル伝達に関して、添加後1時間後からIkBalphaの減少、リン酸化ERK、p38MAPK、JNKの増加を見た。サイトカイン分泌に関してはリポソームを添加した際にIL-6、TNFなどの向炎症性サイトカインのごく少量の増加を見た。またiNOSと、免疫チェックポイント分子の発現量をフローサイトで解析し、リポソーム添加後12時間以降にiNOS、及びPD-L1の発現増加を確認した。これらは先行するラットでのex vivo研究と共通するもので、リポソーム捕捉マクロファージのMDSC様変容と合致した。 B)リポソーム捕捉マクロファージ内での細胞内シグナル伝達細胞内のNF-kB上昇が認められたことでその上流のシグナル伝達を同定すべくRAW264.7細胞のNF-kBルシフェラーゼアッセイを構築して各種阻害剤で刺激した。結果的にリポソーム捕捉マクロファージにおけるNF-kB活性はIKK阻害(IMD0354)で下がり、MyD88阻害(Pepin-MYD)では大きく下がらず、IRE1阻害剤(STF02810)で大きく減少した。リポソーム捕捉マクロファージによるspliced XBP-1の上昇も認められ、リポソーム捕捉マクロファージ内で小胞体ストレスが亢進しておりこれがMDSC様変容に関わる可能性が高まった。
現在までの達成度	現在までの達成度 2: おおむね順調に進展している理由研究の核をなす知見が得られている。引き続き、脂質二重膜小胞体の捕捉から小胞体ストレスに至るメカニズムを解明する
今後の研究の推進方策	１）リポソーム捕捉マクロファージにおける小胞体ストレスの確証ウェスタンブロット、蛍光免疫染色で小胞体ストレスの確証を高める。また電子顕微鏡像の解析で小胞体、ゴルジ体などの細胞内小器官の形態的変化を確認する。２）マクロファージ内脂質分布の変化：リポソームを捕捉した後のエンドソーム内で脂質二十膜が受ける代謝とそれがなぜ小胞体ストレスとの関連を持つのか解析する；長鎖脂肪酸染色による分解されたリポソームの構成成分の局在を解析する。