シングルセル解析を用いたミトコンドリア心筋症の病態解明および治療法の開発

• 研究課題/領域番号: 23K07488
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53020:循環器内科学関連
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 岡崎 敦子 (今井敦子) 順天堂大学, 大学院医学研究科, 准教授 (70761691)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円); 2025年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: ミトコンドリア病 / 心筋症 / ミトコンドリアDNA / ヘテロプラスミー率 / ミトコンドリア心筋症 / シングルセル解析 / シングルセル / ヘテロプラスミー

研究開始時の研究の概要

ミトコンドリア心筋症は、若年では約80%が心不全で死亡する致死的疾患であり、小児期に死亡する重症例と、心肥大のみで成人まで経過する軽症例は、心臓全体のミトコンドリアDNA変異率は同程度である。申請者はシングルセルレベルでのミトコンドリアDNA変異率の不均一性を明らかにした。
本研究では、シングルセルレベルの観点で見えてきた不均一性が重症例と軽症例で異なるか、さらに、ミトコンドリアDNA塩基配列特異的に結合するポリアミド化合物の投与によって不均一性に改善が見られるか、m.3243A>Gを有するミトコンドリア心筋症の皮膚繊維芽細胞を用いて評価し、ミトコンドリア心筋症の治療法の開発を目指す。

研究実績の概要

ミトコンドリアDNAに既知の病的バリアントを有するミトコンドリア心筋症例5症例の皮膚繊維芽細胞を用いて、既存のシングルセルATAC-seqのプロトコールを改良し、ミトコンドリアシングルセルATAC-seqの施行を行った。
代表的なミトコンドリア心筋症であるm.3243A>Gを有するMELAS心筋症患者3名、さらに別のmtDNAの既知病的バリアント(m.8528T>Cおよびm.5537A>G)を有する心筋症患者2名、合計5名から採取した皮膚線維芽細胞を用いてミトコンドリアシングルセルATAC-seqを行った。データ解析に必要なバイオインフォマティクス解析パイプラインを構築し、同パイプラインを用いてシングルセルレベルでの核遺伝子の発現およびミトコンドリアDNAヘテロプラスミー率を定量化した。さらに同一患者から得られた皮膚繊維芽細胞の一部を用いて、ミトコンドリア呼吸鎖酵素活性/酸素消費速度およびdroplet digital PCRを用いた全体でのヘテロプラスミー率も同時に測定した。また新規治療に対する効果判定としての有用性を評価するために、m.3243A>Gを有する心筋症患者1名の患者の皮膚繊維芽細胞を用いて、m.3243A>Gに特異的に結合するポリアミド化合物の投与前後での不均一性の変化を、ミトコンドリアシングルセルATAC-seqを用いて評価を行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

令和5年度-6年度の研究計画としていて当初予定していたミトコンドリア心筋症例における、ミトコンドリアシングルセルATAC-seqの施行およびバイオインフォマティクス解析パイプラインの構築は、予定通りに実行することができた。さらに、次年度に予定していた、m.3243A>Gに特異的に結合するポリアミド化合物の投与前後での不均一性の変化を、ミトコンドリアシングルセルATAC-seqを用いて比較する計画に関しては、1検体を予備実験として今年度に実行することができた。

今後の研究の推進方策

ミトコンドリア心筋症例における、ミトコンドリアシングルセルATAC-seqの施行は、症例数を増やして次年度も行う計画である。代表的なミトコンドリア心筋症であるm.3243A>Gを有するMELAS心筋症患者に関しては、重症例と軽症例それぞれの皮膚線維芽細胞を用いてミトコンドリアシングルセルATAC-seqを行い、疾患重症度と不均一性の関係を評価する。さらに同一患者から得られた皮膚繊維芽細胞の一部を用いて、ミトコンドリア呼吸鎖酵素活性/酸素消費速度およびdroplet digital PCRを用いた全体でのヘテロプラスミー率も同時に測定を行い、全体でのヘテロプラスミー率とシングルセルレベルでの不均一性の乖離を評価する。
m.3243A>G特異的に結合するポリアミド化合物の投与前後での不均一性の変化を比較する計画については、ミトコンドリアシングルセルATAC-seqが完了したm.3243A>Gを保有する心筋症患者から採取した皮膚繊維芽細胞を培養し、化合物投与後に、ミトコンドリアシングルセルATAC-seqを行い、投与前と比較しシングルセルレベルでのヘテロプラスミー率の不均一性の改善度を評価する。

研究成果

• [雑誌論文] Strategic validation of variants of uncertain significance in ECHS1 genetic testing (2023)
  • 著者名/発表者名: Yoshihito Kishita, Ayumu Sugiura, Takanori Onuki, Tomohiro Ebihara, Tetsuro Matsuhashi, Masaru Shimura, Takuya Fushimi, Noriko Ichino, Yoshie Nagatakidani, Hitomi Nishihata, Kazuhiro R Nitta, Yukiko Yatsuka, Atsuko Imai-Okazaki, Yibo Wu, Hitoshi Osaka, Akira Ohtake, Kei Murayama, Yasushi Okazaki
  • 雑誌名: Journal of Medical Genetics 巻: Online ahead of print 号: 10 ページ: 1006-1015
  • DOI: 10.1136/jmg-2022-109027
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Association between maternally inherited deafness, epilepsy, and intellectual disability and the m.12207G > A MT-TS2 pathogenic variant in a Japanese family (2023)
  • 著者名/発表者名: Sayaka Suzuki-Ajihara, Megumi Saito-Tsuruoka, Hiroko Harashima, Katsumi Arai, Hiroyoshi Koide, Yukiko Yatsuka, Atsuko Imai-Okazaki, Yasushi Okazaki, Kei Murayama, Chikahiko Numakura, Yuko Akioka, Akira Ohtake, Hitoshi Osaka, Akira Ohtake, Kei Murayama, Yasushi Okazaki
  • 雑誌名: Mol Genet Metab Rep 巻: 35 ページ: 100966-100966
  • DOI: 10.1016/j.ymgmr.2023.100966
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] ミトコンドリア病モデルマウスを用いたミトコンドリアDNAヘテロプラスミー率の分布に関する検討 (2023)
  • 著者名/発表者名: 岡﨑 敦子、美野輪 治、谷 春菜、八塚 由紀子、野間 将平、平田 智子、田上 道平、尾崎 心、杉浦 歩、松永 綾子、杉山 洋平、大竹 明、村山 圭、中田 和人、岡﨑 康司
  • 学会等名: 第22回日本ミトコンドリア学会年会
• [学会発表] enetic Background and long-term prognosis of cardiomyopathy in 313 Mitochondrial Disease Patients (2023)
  • 著者名/発表者名: Atsuko Okazaki, Ayako Matsunaga, Yukiko Yatsuka, Yoshihito Kishita, Ayumu Sugiura, Yohei Sugiyama, Takuya Fushimi, Masaru Shimura, Keiko Ichimoto, Makiko Tajika, Tomohiro Ebihara, Tetsuro Matsuhashi, Tomoko Tsuruoka, Tomoko Hirata, Atsuhito Takeda, Akira Ohtake, Kei Murayama,, Yasushi Okazaki
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第68回大会（HGA2023合同開催）
  • 国際学会
• [学会発表] Impact of measuring heteroplasmy of causative mitochondrial DNA variants at the single-cell level in patients with mitochondrial disease (2023)
  • 著者名/発表者名: Atsuko Imai-Okazaki, Yukiko Yatsuka, Ayumu Sugiura,Masato Arao, Masaru Shimura, Tomohiro Ebihara, Takanori Onuki, Keiko Ichimoto, Akira Ohtake, Kei Murayama, Yasushi Okazaki
  • 学会等名: The 23th Annual Meeting of KSIMD
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] ミトコンドリア心筋症の長期予後および遺伝的背景 (2023)
  • 著者名/発表者名: 岡﨑 敦子, 松永 綾子, 八塚 由紀子, 杉浦 歩, 武田 充人, 大竹 明, 村山 圭, 岡﨑 康司
  • 学会等名: 第32回日本心筋疾患学会/第42回日本小児循環動態研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 分節重複領域に存在する染色体部分欠失に対する遺伝統計学的アプローチ (2023)
  • 著者名/発表者名: Kohta Nakamura, Atsuko Imai-Okazakia, Akira Hasegawa, Takeya Kasukawa, Atsushi Kondo, Yukiko Yatsuka, Masaru Shimura, Tomohiro Ebihara, Takanori Onuki, Keiko Ichimoto, Akira Ohtake, Kei Murayama, Yasushi Okazaki
  • 学会等名: 2023年日本バイオインフォマティクス学会年会・第12回生命医薬情報学連合大会（IIBMP2023）
• [図書] 臨床基礎研究につながる分子生物学 １０章バイオインフォテックスによるゲノム医学研究 (2024)
  • 著者名/発表者名: 岡﨑 敦子、岡﨑 康司
  • 総ページ数: 368
  • 出版者: クリニコ出版
  • ISBN: 9784910396408
• [産業財産権] 肥大型心筋症治療剤 (2023)
  • 発明者名: 順天堂大学
  • 権利者名: 順天堂大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2023
  • 外国