| 研究課題/領域番号 |
23K07662
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分53030:呼吸器内科学関連
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
磯谷 澄都 藤田医科大学, 医学部, 臨床教授 (10351032)
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| 研究分担者 |
今泉 和良 藤田医科大学, 医学部, 教授 (50362257)
山本 直樹 藤田医科大学, バイオリソース室, 教授 (00267957)
平松 範子 藤田医科大学, バイオリソース室, 技術員 (10802209)
加藤 由布 藤田医科大学, バイオリソース室, 技術員 (50773412)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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| キーワード | 喘息 / 気管上皮細胞 / 肺線維芽細胞 / 不死化細胞 / 薬効評価 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
独自手法で作製する不死化健常／気管支喘息患者由来の線維芽細胞ゲル層の上部に、健常または喘息患者由来不死化気管上皮細胞を培養して模擬気管上皮を形成し、他方インサートの下部には平滑筋細胞を播種した異なる疾患由来細胞で形成され、長期的かつ多施設で安定した反復実験が可能な新たな三次元培養気管支モデルを作製する。
次に、気道リモデリングに関連する因子、メカニカルストレスや被験薬剤のばく露による肺線維芽細胞の増殖・分化転換・コラーゲン合成、および喘息患者末梢血好酸球や単球iPS細胞から分化させた好酸球の共培養や治療薬添加による薬効評価を検討する。
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| 研究実績の概要 |
独自手法で作製する不死化健常／気管支喘息患者由来の線維芽細胞ゲル層の上部に、健常または喘息患者由来不死化気管上皮細胞を培養して模擬気管上皮を形成し、他方インサートの下部には平滑筋細胞を播種した異なる疾患由来細胞で形成され、長期的かつ多施設で安定した反復実験が可能な新たな三次元培養気管支モデルを作製する。
2023年度では、まず健常者および喘息患者由来の三次元培養気管支モデルを作製するための基盤となる健常人および喘息患者由来の気管上皮細胞を入手し、不死化細胞株作製のための条件検討を行った。健常人および喘息患者由来の気管上皮細胞は、残念ながら日本では患者から直接採取することはできないため、欧米の研究用として販売されている健常人および喘息患者由来の気管上皮細胞を購入した。本年度においては、初代分離ではなく３継代程度されたロットしか入手することができず、かなりバラツキが大きなロットであったため、細胞品質が悪い状態であった。そこで、研究用細胞を販売している欧米の企業と直接交渉を行い、２継代目で、細胞のviabilityの良いロットを入手することができた。
健常人／喘息患者・慢性閉塞性疾患患者の肺線維芽細胞、および健常人／喘息患者由来の平滑筋細胞についても同様にviabilityの良いロットを入手できるよう、手配済みである。
さらに、分担研究者の山本が開発したらが報告した不死化遺伝子の発現を薬剤添加の有無で制御でき、遺伝学的に機能していないとされる部位に特異的に不死化遺伝子を導入できるベクターの更なる改良設計を行い、不死化ベクターの合成を外注依頼したところ、納品物に不備があり、納品遅延となってしまったため、健常人および喘息患者由来の気管上皮細胞の不死化細胞株樹立は2024年度から実施することとした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
不死化ベクターの合成を外注依頼したところ、納品物に不備があり、納品遅延となった。2024年5月の時点で不死化ベクターの一部は納品されたため、予定していた不死化遺伝子導入実験を2024年度から実施することとなった。
また、大学の施設運用の関連で、研究室を引っ越ししなければならなかったため、2023年11月から2024年1月の間は実質的な実験を行うことができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) 不死化細胞株の作製：健常人／喘息患者・慢性閉塞性疾患患者の肺線維芽細胞、および健常人／喘息患者由来の平滑筋細胞を準備する。これらの細胞と2023年度に準備した健常人および喘息患者由来の気管上皮細胞に対して、2023年度より設計・合成を開始した新たな不死化遺伝子の発現を制御でき、特異的領域に不死化遺伝子を導入できるベクターを細胞に導入し、発現制御が可能な不死化細胞株を作製する。これらの細胞を用いて気管支上皮三次元細胞モデルの作製を行う。
2) 気管支上皮三次元細胞モデルの作製：三次元培養方法にて、健常人由来細胞、喘息患者由来細胞、および慢性閉塞性肺疾患患者由来の気管支上皮三次元細胞モデルをそれぞれ作製し、由来細胞の違いによる比較検証を行う。インサートの外側には、不死化した健常人、または喘息患者由来平滑筋細胞を播種する。なお、平滑筋細胞はインサートの外側に播種する前に通常培養した細胞と伸展刺激などのメカニカルストレスをかけた細胞を用いて、平滑筋に対するメカニカルストレスがインサート内部の線維芽細胞や気管支上皮細胞に与える影響について、遺伝子やLC-MS/MSを用いたタンパク質発現解析を行う。
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