| 研究課題/領域番号 |
23K07704
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分53040:腎臓内科学関連
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
長瀬 美樹 杏林大学, 医学部, 教授 (60302733)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | メカノバイオロジー / Piezo1 / Piezo2 / 遺伝子改変マウス / ポドサイト / メサンギウム細胞 / メカノセンサー |
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| 研究開始時の研究の概要 |
申請者はこれまでに、マウスやラットの腎臓において、Piezo1は糸球体、尿細管、集合管の種々の細胞に発現すること、一方、Piezo2は糸球体メサンギウム細胞と傍糸球体装置のレニン産生細胞に限局して発現すること、脱水モデルや高血圧性腎障害モデルで発現が変化し、血管周囲線維芽細胞で強発現することを明らかにした。本研究では遺伝子改変マウスを用いて、生体におけるこれら分子の機能的役割を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、Piezo1, Piezo2のKOマウスを、腎臓のメカノバイオロジー的に重要な役割を持つ細胞に特異的に作製し、その病態解析を行うことを目的とする。本目的を達成するために、今年度は正常マウスやレポーターマウスを用いた発現調節解析、メサンギウム細胞・線維芽細胞・ポドサイト特異的KOマウスの作製と形態機能解析を行った。
まず、正常マウスにおいて片側尿管閉塞(UUO)モデルを作製してPiezo2発現を定量PCRで解析したところ、時間依存的な発現上昇を認めた。正常マウスとPiezo2-GFPレポーターマウスを用いてUUOモデルを作製し、Piezo2 mRNAの局在とPiezo2-GFP融合蛋白の局在を解析したところ、両者は概ね一致していた。次に、Pdgfrb-Cre/ERT2マウスとPiezo2 flox/floxマウスを掛け合わせ、タモキシフェン誘導性細胞特異的Piezo2 KOマウスを作製した。産仔のうちCre陽性ホモマウスの割合が非常に低かったため、別のPdgfrb-Cre/ERT2マウスを購入し、ようやく安定したCre陽性ホモマウスを得ることができた。Cre陰性マウス、Cre陽性ヘテロマウス、Cre陽性ホモマウスにタモキシフェンを投与し、時期・細胞特異的KOマウスを作製し、十分なPiezo2欠損を生じるタモキシフェンの投与法を確立した。本マウスを用いて腎障害モデルを作製し、KOマウスと対照マウスで腎障害の表現型を比較している。Nphs1-Cre Piezo1 flox/floxマウスを用いてポドサイト特異的Piezo1 KOマウスを作製し、KOマウスと対照マウスで腎障害の表現型を比較し、Piezo1が欠損することで腎障害が変化するメカニズムを解析している。
以上のように、Piezo1, 2の細胞特異的な生理学的・病態生理学的役割を解析する系が確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Pdgfrb-Cre/ERT2マウスを購入してPiezo2 flox/floxマウスと掛け合わせたが、Cre陽性ホモマウスがなかなか得られず、別系統のPdgfrb-Cre/ERT2マウスを購入し直したところ、今度は繁殖がうまくいき、安定したCre陽性ホモマウスを得ることができるようになった。Nphs1-Cre Piezo1 flox/floxマウスも安定したCre陽性ホモマウスを得ることができている。このように、現在Piezo1, 2の細胞特異的な生理学的・病態生理学的役割を解析する系が樹立でき、解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、遺伝子改変マウスを作製してPiezo1, Piezo2が腎病変形成過程に果たす役割を解明し、新規治療法開発の端緒とする。本目的を達成するために、レポーターマウスを用いた発現調節解析、メサンギウム細胞・線維芽細胞・ポドサイト特異的KOマウスの作製と形態機能解析、培養細胞を用いたメカノ感知応答分子機構の解析を行い、実験動物、細胞、分子レベルで解析を実施する。
初年度の研究で、足細胞特異的Piezo1 KOマウス、Pdgfrb陽性細胞特異タモキシフェン誘導性Piezo2 KOマウスを樹立することができ、障害モデルの解析に着手したので、次年度以降、その解析を継続するとともに、in vitro細胞培養系での検討も行い、その病態生理的役割とシグナルカスケードを明らかにする。
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