| 研究課題/領域番号 |
23K07735
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分53050:皮膚科学関連
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
松崎 康司 弘前大学, 医学研究科, 准教授 (50322946)
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| 研究分担者 |
澤村 大輔 弘前大学, 医学研究科, 客員研究員 (60196334)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 類天疱瘡 / BP230 / 水疱性類天疱瘡 / BPAG1 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
我々はBP230ノックアウトマウスをBP230タンパクで免疫させ、そのリンパ球を免疫不全マウスに移植することにより、水疱性類天疱瘡（BP）様の皮膚症状が現れることを確認、BP230-BPモデルマウス作製に成功した。表皮下水疱とともに真皮表皮境界部へのIgG沈着が確認でき、抗BP230抗体の病原性を証明した。本研究ではこれらの成果を発展させ、細胞内タンパクであるBP230の細胞外への露呈がBP発症の誘因と考え、外的要因によるBP230の局在の変化、ならびに抗原抗体反応後の水疱形成の機序を解明する。本研究の成果は、自己免疫性疾患の発症機序の解明や予防法の開発への波及効果もあり、臨床的意義が大きい。
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| 研究実績の概要 |
本研究の【目的】である「抗BP230抗体が抗原を認識し結合する誘因、要因を明らかにして、表皮下水疱が形成される機序を解明する」を達成するため、3年間の研究期間内に6つのテーマに分けて研究を進める。初年度は、BP230-BP発症の誘発因子を解明する。次年度以降は、外的刺激による表皮細胞のBP230タンパクの発現やその局在の変化の解析、ならびに抗BP230抗体によるBP230-BPモデルマウスを作製、その発症機序を解明する予定である。
＜BP230-BPモデルマウスの作製、誘導因子の同定＞1.BP230-KOマウスにrBP230を2週に1回、完全・不完全フロイントを用いて免疫させた。2.皮下注射5週後に採血、血清を回収。ELISAにてBP230に対する抗体価を確認した。3.免疫のついたBP230-KOマウスから脾臓、リンパ節を採取、リンパ球を抽出。4.免疫不全マウスにリンパ球を移植。4.移植1週後より、BP誘導刺激としてUVB、外傷、サイトカイン静注を行った。5.BP230-BPの発症率を無刺激群であるコントロールと比較検討した。
＜外的刺激によるBP230タンパクの発現量ならびにその局在の変化の解析＞1.スライドチャンバー上にヒト培養表皮細胞を撒き、上記外的刺激を加えBP230タンパク発現や細胞内での局在の変化についてコントロールと比較、検討。2.マウス背部皮膚に同様の外的刺激を加え、経時的に皮膚生検を行い、BP230タンパクの細胞外への露呈や細胞内での局在の変化を蛍光抗体法で確認。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
BP230-BPモデルマウスの作製、誘導因子の同定のために、リコンビナントBP230タンパクを作製し、予定通りにBP230-KOマウスに完全・不完全フロイントを用いて免疫させた。皮下注射5週後に採血、血清を回収。ELISAにてBP230に対する抗体価を確認できた。免疫のついたBP230-KOマウスから脾臓、リンパ節を採取、リンパ球を抽出し、免疫不全マウスにリンパ球を移植できた。計画通り、実験・研究は進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
外的刺激によるBP230タンパクの発現量ならびにその局在の変化の解析
1.スライドチャンバー上にヒト培養表皮細胞を撒き、上記外的刺激を加えBP230タンパク発現や細胞内での局在の変化についてコントロールと比較、検討する。2.マウス背部皮膚に同様の外的刺激を加え、経時的に皮膚生検を行い、BP230タンパクの細胞外への露呈や細胞内での局在の変化を蛍光抗体法で確認する。
ハイブリドーマ作製、モノクローナル抗体精製
1.BP230-BPモデルマウスより脾臓、リンパ節を採取、リンパ球を抽出し、マウスミエローマ細胞SP2/0-Ag14と融合させる。2.rBP230タンパクを用いたELISAで、抗体価が高いクローンを選択する。3.ヌードマウスに腹腔内投与、腹水を回収、モノクローナル抗体を精製する。4.ELISA、ウエスタン法、蛍光染色にてBP230タンパクへの結合能を確認する。
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