siRNAによる血管型エーラス・ダンロス症候群の新規治療開発を目指したin vitro研究

• 研究課題/領域番号: 23K07773
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53050:皮膚科学関連
• 研究機関: 獨協医科大学
• 研究代表者: 林 周次郎 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (00599871)
• 研究分担者: 井川 健 獨協医科大学, 医学部, 教授 (00372441)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2027-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2026年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円); 2025年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: エーラス・ダンロス症候群 / siRNA / SNP / 3型コラーゲン / COL3A1 / ドミナントネガティブ効果 / 血管型エーラス・ダンロス症候群

研究開始時の研究の概要

これまでに当施設では約50名のvEDS患者を遺伝学的検査により診断している。そのうち，皮膚由来線維芽細胞が存在し，標的とする2つのSNPを有する患者を抽出し，その中からCDNのキャピラリーシークエンスにより、病的バリアントとSNPの位置関係が検出可能な距離に存在する，本実験に適した患者を特定する。
最終的な実験として研究対象細胞にsiRNAを導入して、ノックアウト効率の確認と共に、表表現型の改善（蛋白レベル、小胞体ストレスマーカーや他の蛋白質の遺伝子発現量、電子顕微鏡の細胞観察）をする。
期待される効果は，優性阻害効果を回避しハプロ不全化の誘導である。

研究実績の概要

本研究に最終的な結果は、にCOL3A1の対立遺伝子の片方の病的変異をノックアウトすることにより、表現型の改善が見られるかどうかである。表現型は細胞の観察、とくに小胞体ストレスの改善と、3型プロコラーゲンの発現量で評価する。まず、必要なのは血管型エーラス・ダンロス症候群（vEDA）と疾患陰性コントロール群の比較である。
本年度では、これまで当院で診断したvEDS患者、約50名のレジストリの作成を行った。遺伝子変異の種類と、今回の研究のノックアウトのターゲットにしているSNPの有無と、遺伝子変異の位置関係を登録した。さらに、3型プロコラーゲンの発現量、カルテ情報（性別、年齢、臨床症状について）も登録した。同様に疾患陰性コントロールについては、COL3A1に遺伝子変異を認めていことを確認できている約70名のサンプルの、カルテ情報をレジストリに登録した。
vEDSでは電子顕微鏡による、膠原線維束の観察により膠原線維束の大小不同のを認めている。膠原線維束の観察は、本補助研究でのアウトカムにはしていないが、膠原線維束の形態異常と、小胞体ストレスには関連性があることが示唆されている。膠原線維束の大小不同を、変動件数で定量化しレジストリに登録した。同様に新患陰性コントロールについても膠原線維束を観察し、変動係数を算出して比較した。これまでの報告よりも、サンプルサイズは大幅に多く、さらに膠原線維束と小胞体ストレス、患者の症状の発現系の違いについてを、昨年度に報告した。（Front Genet. 2023 doi: 10.3389/fgene.2023.1238209.）
次年度は、COL3A1上にあるsiRNAの標的SNPに、特異的に反応してノックアウトを誘導し、SNPを含まない対立遺伝子には影響がすくない、siRNA鎖を設定し、実際に患者由来の培養皮膚線維芽細胞に導入する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

患者レジストリの作成は非常に時間がかかる作業であったが、論文報告（アクセプト）に至るまで、完成されたものを作成することができた。

今後の研究の推進方策

次年度は、遺伝子、細胞を扱う機会が増えると思われる。siRNAの設計には時間がかかると思われるが、設計されたsiRNAの導入による細胞の表現型の評価がより重要になってくる。
疾患群とコントロール群での小胞体ストレスの評価方法、3型プロコラーゲンの発現（定量化）についても、検討していく予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Clinical features and morphology of collagen fibrils in patients with vascular Ehlers?Danlos based on electron microscopy (2023)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa Satoko、Hayashi Shujiro、Sairenchi Toshimi、Miyamoto Manabu、Yoshihara Shigemi、Kobashi Gen、Yamaguchi Tomomi、Kosho Tomoki、Igawa Ken
  • 雑誌名: Frontiers in Genetics 巻: 14
  • DOI: 10.3389/fgene.2023.1238209
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Case report: Mild phenotype of a patient with vascular Ehlers?Danlos syndrome and COL3A1 duplication mutation without alteration in the [Gly-X-Y] repeat sequence (2023)
  • 著者名/発表者名: Hayashi Shujiro、Yamaguchi Tomomi、Kosho Tomoki、Igawa Ken
  • 雑誌名: Frontiers in Genetics 巻: 13
  • DOI: 10.3389/fgene.2022.1017446
• [雑誌論文] Comprehensive genetic screening for vascular Ehlers-Danlos syndrome through an amplification-based next generation sequencing system. (2023)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi T, Hayashi S, Hayashi D, Matsuyama T, Koitabashi N, Ogiwara K, Noda M, Nakada C, Fujiki S, Furutachi A, Tanabe Y, Yamanaka M, Ishikawa A, Mizukami M, Mizuguchi A, Sugiura K, Sumi M, Yamazawa H, Izawa A, Wada Y, Fujikawa T, Takiguchi Y, Wakui K, Takano K, Nishio S, Kosho T.
  • 雑誌名: Am J Med Genet A 巻: 191 号: 1 ページ: 37-51
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.62982
  • 査読あり / オープンアクセス