| 研究課題/領域番号 |
23K07802
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分54010:血液および腫瘍内科学関連
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
松川 敏大 北海道大学, 大学病院, 特任助教 (20963169)
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| 研究分担者 |
平林 真介 北海道大学, 大学病院, 助教 (50769635)
小野澤 真弘 北海道大学, 大学病院, 講師 (70455632)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
2025年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | NUP98::NSD1 / 急性骨髄性白血病 / FLT3-ITD |
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| 研究開始時の研究の概要 |
急性骨髄性白血病（AML）の予後を規定する染色体核型は約25％が正常核型を呈する。正常核型AMLは約2%にNucleoporin 98kDa (NUP98)変異が検出され、その中でもNSD1とのキメラ遺伝子複合体が成人臨床検体で比較的多く見つかっているが予後不良である。NUP98::NSD1陽性白血病は初回緩解導入率が低く再発が多いことが知られており、NUP98::NSD1陽性白血病は白血病細胞自体に薬剤耐性が生じていると考えられる。
本課題では、ヒト検体を用いて予後不良であるNUP98::NSD1陽性AMLの発症機構や薬剤耐性を解明することを目的とする。
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| 研究実績の概要 |
北海道白血病ネットのヒト臨床検体からNUP98::NSD1をクローニングした。NUP98::NSD1全長が非常に長いため、全長をそのままクローニングを行うことは困難であった。まず、全長を前半部分と後半部分に分けてクローニングを行い、前半・後半部分をそれぞれPCRで増幅しベクターを制限酵素で切断した。切断部分にNUP98::NSD1の前半・後半部分を挿入し、形質転換後にプラスミド抽出を行った。それぞれの配列をサンガーシークエンスで確認すると一部に塩基置換が認められ、PCR法などによる修復を行ない、シークエンスを復元することができた。前半部分と後半部分を結合させ、全長をサンガーシークエンスで確認し、変異のないことを確認した。
当初、出来上がったNUP98::NSD1をB細胞系細胞株であるBa/F3に遺伝子導入したのちに薬剤選択により細胞株を樹立した。しかし、樹立したと思われる細胞株においてNUP98::NSD1の融合蛋白を確認できなかった。同様の手法で、他のヒト細胞株にも遺伝子導入を行ったが、同様に融合蛋白を認めることが困難であった。
薬剤耐性株は樹立できているが目的とする蛋白の発現が見られない。
この原因については判然とはしていないが、目的とする蛋白の発現が見られない以上は薬剤耐性にはなっているが何らかの原因で融合蛋白が作成できていないと考えた。
現在は、別のベクターに乗せ替えを行ってから、再度遺伝子導入を行い、今後NUP98::NSD1陽性ヒト細胞株の樹立を目指すことを目標としている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
NUP98::NSD1陽性ヒト細胞株の樹立に難渋しており、現在別のベクターによる遺伝子導入を行っている。細胞株が確立しないと、今後予定している研究には辿り着けないため、現時点では遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
まずは目標とする細胞株の樹立を目指す。
目的とした細胞株ではないが、遺伝子導入ができた細胞株では融合蛋白の発現が確認できており、今後計画している細胞株におけるNUP98::NSD1陽性細胞株の樹立を目指し、FLT3-ITDの共発現細胞株や樹立した細胞株の次世代シーケンスによる解析、薬剤耐性に関するデータの蓄積を目指す。
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