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SARS-CoV-2による血小板血栓の形成メカニズムの解析

研究課題

研究課題/領域番号 23K07831
研究種目

基盤研究(C)

配分区分基金
応募区分一般
審査区分 小区分54010:血液および腫瘍内科学関連
研究機関山梨大学

研究代表者

佐々木 知幸  山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (40739124)

研究分担者 井上 克枝  山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (10324211)
築地 長治  山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (20710362)
白井 俊光  山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (50710381)
大石 沙織  山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (50894094)
研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2026-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2024年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
キーワードCOVID-19 / SARS ~CoV-2 / 血栓症 / 血小板 / SARS-CoV-2
研究開始時の研究の概要

我々は,すでに,SARS-CoV-2が宿主細胞へ感染するために必須とされるスパイクタンパク質の遺伝子組換え体の作製と精製システムを構築している.さらに,全血を用いたマイクロ流路実験において,アルファ株由来のスパイクタンパク質が血栓形成を引き起こす知見を得ており,特徴の異なる他の変異株(デルタやオミクロン株など)の解析と比較から本研究を展開する.

研究実績の概要

新型コロナウイルス感染症(以降COVID-19)の世界的大流行が始まって以来,その病態の重症化に血栓症が深く関与していることが知られている.また,COVID-19は,その原因ウイルスSARS-CoV-2のゲノム変異を繰り返しながら流行が継続しており(従来株,アルファ,デルタやオミクロン株など),罹患後も数か月間に渡って血栓症のリスクが高いと報告されている.しかしながら,COVID-19患者において,血栓形成の本体である血小板が過剰な活性化状態にあることが認められているものの,SARS-CoV-2と血小板との相互作用については一致した見解がなく,血栓形成 の分子メカニズムは不明のままである.本研究では,このメカニズムを解明し,根拠に基づく治療および予防に繋げることが目的である.
我々は,すでに,SARS-CoV-2が宿主細胞へ感染するために必須とされるスパイクタンパク質の遺伝子組換え体の作製と精製システムを構築している.さらに,全血を用いたマイクロ流路実験において,アルファ株由来のスパイクタンパク質が血栓形成を引き起こす知見を得ており,特徴の異なる他の変異株(デルタやオミクロン株など)の解析と比較から本研究を展開する.令和5年度(2023)では,準備段階として,アルファ株に加えて,従来株(Wuhan D614G変異)およびオミクロン株由来のスパイクタンパク質遺伝子をクローニングし,発現ベクターを構築した.さらに,CHO細胞への遺伝子導入,得られた培養液からのスパイクタンパク質の精製,ACE2への結合機能の確認を進めた.

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

スパイクタンパク質による直接的な血小板の活性化は一貫して認めていない(これに関する報告は複数あり,議論は割れている).私たちは,スパイクタンパク質による血栓形成能については,全血を用いたマイクロ流路実験で再現性良く観察できている.この流路実験には,ミリグラムオーダーのスパイクタンパク質が必要である.しかしながら,スパイクタンパク質の発現量の低さのため,今年度クローニングした従来株やオミクロン株由来のスパイクタンパク質の準備がやや遅れている.発現量を改善するための手法も検証しながら進めている(遺伝子導入方法や細胞株の変更,恒常的発現細胞の樹立など)
一方で,R6年度(次年度)からの予定であったSARS-CoV-2ウイルスを用いた検証のためのウイルス培養はすでに進めている.高力価のウイルスを得られている.
以上のことから,全体の進捗状況は,やや遅れていると評価した.

今後の研究の推進方策

SARS-CoV-2のスパイクタンパク質が血小板血栓の形成に関与することが予想されているが,不明点が多く(データの信頼性も含めて),直接的な証拠がいまだにない.我々は事前の検討において,その証拠を得ており,そのメカニズムの解明のためのスタート地点に立っている.スパイクタンパク質あるいはウイルスが引き起こす血栓形成の分子メカニズムを解明する手法として,マイクロ流路デバイスを採用する.この方法は,マイクロ流路内に全血を流し,顕微鏡下でリアルタイムあるいはエンドポイントの血 栓形成を観察することが可能である.サンプルが全血の場合は処理が不要で簡便であり,さらに血液を再構成することで免疫細胞などとの相互作用によって血栓形成に寄与しているかを明らかにすることが可能である.
次年度は,本年度に引き続き,従来株とアルファ株由来のスパイクタンパク質の準備を進める(ミリグラムオーダー).
実験は1~5を計画している.1~3を優先し,進行状況を考慮して,4と5と進める.
1:各株(アルファ,デルタ,オミクロン)由来のスパイクタンパク質による血栓形成能の検証. 2:再構成した全血を用いたスパイクタンパク質に より惹起される血栓形成メカニズムの解明. 3:血小板/巨核球におけるACE2発現の有無の検証とACE2獲得能の検証. 4:SARS-CoV-2ウイルスあるいはスパイクタンパク質による血小板産生に与える効果の検証. 5:SARS-CoV-2以外のウイルス由来の表面タンパク質による血栓形成能の検証.

報告書

(1件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 研究成果

    (10件)

すべて 2023 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (6件) (うち国際学会 1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] C-type lectin-like receptor-2 (CLEC-2) is a key regulator of kappa-carrageenan-induced tail thrombosis model in mice2023

    • 著者名/発表者名
      Yokomori Ryohei、Shirai Toshiaki、Tsukiji Nagaharu、Oishi Saori、Sasaki Tomoyuki、Takano Katsuhiro、Suzuki-Inoue Katsue
    • 雑誌名

      Platelets

      巻: 34 号: 1 ページ: 1-11

    • DOI

      10.1080/09537104.2023.2281941

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] High plasma soluble CLEC-2 level predicts oxygen therapy requirement in patients with COVID-192023

    • 著者名/発表者名
      Oishi Saori、Ueda Makyo、Yamazaki Hirokazu、Tsukiji Nagaharu、Shirai Toshiaki、Naito Yuna、Endo Masumi、Yokomori Ryohei、Sasaki Tomoyuki、Suzuki-Inoue Katsue
    • 雑誌名

      Platelets

      巻: 34 号: 1 ページ: 1-6

    • DOI

      10.1080/09537104.2023.2244594

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Cancer-associated fibroblasts promote venous thrombosis through podoplanin/CLEC-2 interaction in podoplanin-negative lung cancer mouse model2023

    • 著者名/発表者名
      Shirai Toshiaki、Tsukiji Nagaharu、Sasaki Tomoyuki、Oishi Saori、Yokomori Ryohei、Takano Katsuhiro、Suzuki-Inoue Katsue
    • 雑誌名

      Journal of Thrombosis and Haemostasis

      巻: 21 号: 11 ページ: 3153-3165

    • DOI

      10.1016/j.jtha.2023.07.005

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] 硫酸化多糖カラギナンは、血小板受容体C-type lectin-like receptor2依存的に血小板凝集を惹起する2023

    • 著者名/発表者名
      横森良平、大石沙織、佐々木知幸、髙野勝弘、井上克枝
    • 学会等名
      第70回日本臨床検査医学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] The molecular basis of carrageenan-induced thrombosis involves platelet activation via C-type lectin like receptor 2 (CLEC-2)2023

    • 著者名/発表者名
      Ryohei Yokomori, Toshiaki Shirai, Saori Oishi, Tomoyuki Sasaki, Nagaharu Tsukiji, Katsuhiro Takano, Katsue Suzuki-Inoue
    • 学会等名
      ISTH 2023
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 新型コロナウイルスによる血小板血栓形成メカニズムの解明2023

    • 著者名/発表者名
      佐々木知幸、白井俊光、築地長治、大石沙織、横森良平、髙野勝弘、森石恆司、井上克枝
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 硫酸化多糖カラギナンによるヒト血小板活性化機構2023

    • 著者名/発表者名
      横森良平、白井俊光、佐々木知幸、築地長治、大石沙織、髙野勝弘、井上克枝
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 可溶型CLEC-2はCOVID-19患者の酸素療法の必要性を予測する2023

    • 著者名/発表者名
      大石沙織、上田眞叶、山﨑浩和、築地長治、白井俊光、内藤悠菜、遠藤真澄、佐々木知幸、井上克枝
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 鉄によるCLEC-2依存性血小板活性化機構とその生理的意義2023

    • 著者名/発表者名
      築地長治、横森良平、田草川一穂、大石沙織、白井俊光、佐々木知幸、髙野勝弘、井上克枝
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [備考] 山梨大学医学部附属病院検査部、輸血細胞治療部、大学院臨床検査医学講座のホームページ

    • URL

      https://clnlabmed.yamanashi.ac.jp/

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書

URL: 

公開日: 2023-04-13   更新日: 2024-12-25  

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