| 研究課題/領域番号 |
23K07896
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分54020:膠原病およびアレルギー内科学関連
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| 研究機関 | 帝京平成大学 |
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研究代表者 |
秋山 晴代 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (50420229)
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| 研究分担者 |
栗坂 知里 帝京平成大学, 薬学部, 助教 (00846785)
中村 亮介 国立医薬品食品衛生研究所, 医薬安全科学部, 室長 (50333357)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2026年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2025年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | EXiLE法 / 架橋 / FcεRI / 近接ライゲーションアッセイ / セルフリー / IgE架橋 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
EXiLE法は高感度にIgEの架橋活性を評価できる画期的な試験法であるが、細胞障害性のある検体を調べることが難しいという欠点がある。そこで本研究では、細胞障害性を克服した上でIgEの架橋活性を評価しうる、セルフリー型高感度アレルギー試験法の開発を目指す。
具体的には、2種類のOligo DNAプローブ融合FcεRI α鎖を作製し、近接ライゲーションアッセイ法を利用してセルフリー条件下IgEと抗原結合により導かれるFcεRIの架橋を、ローリングサークル増幅で得られる環状DNA量をリアルタイムPCR法で評価する、新しいアレルギー試験系を開発する。
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| 研究実績の概要 |
アレルギー試験法EXiLE法は、ヒトの高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現させた培養マスト細胞株を、アレルギー患者血清(IgE)で感作し、抗原添加後の細胞の活性化をルシフェラーゼアッセイにより検出する手法で、高感度にIgEの架橋活性を評価できる画期的な試験法である。しかし一方で、EXiLE法には一部の血清や抗原が細胞障害性を示し正確な測定が出来ない場合があることを見出している。そこで本研究では、細胞障害性を克服した上で架橋活性を評価しうる、セルフリー型高感度アレルギー試験法の開発を目指す。具体的には、2種類のOligo DNAプローブ融合FcεRI α鎖を作製し、近接ライゲーションアッセイ法を利用してセルフリー条件下IgEと抗原結合により導かれるFcεRIの架橋を、ローリングサークル増幅で得られる環状DNA量をリアルタイムPCR法で評価する、新しいアレルギー試験系を開発する。
令和5年度は、セルフリーEXiLE法の材料作製にあたり基本方針を立案した。まずヒトFcεRI α鎖の細胞外ドメインまでを可溶化した状態で発現させ、そのC末端にオリゴヌクレオチドプローブを結合させることにした。FcεRI α鎖の細胞外ドメインにリジンを結合させた配列をデザインし、FcεRI α－ECK配列を作製した。次年度は、pcDNA3.1(+)ベクターに上記インサート配列を挿入し、動物細胞タンパク質合成システムによりリコンビナントタンパク質を調製する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
消耗品が入手困難であったこと、さらに突発的な検査業務が入ったことにより、研究時間が大幅に減少したため、当初の予定どおりに検討が進まなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、pcDNA3.1(+)ベクターにFcεRI α－ECK配列を挿入し、動物細胞タンパク質合成システムによりリコンビナントタンパク質を調製する。
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