| 研究課題/領域番号 |
23K07942
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分54030:感染症内科学関連
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
津々木 博康 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 講師 (40586608)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | 細菌毒素 / 腸管出血性大腸菌 / 宿主免疫 / 小胞体ストレス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
腸管出血性大腸菌（EHEC）が産生する毒素Subtilase cytotoxin（SubAB）は、宿主細胞に侵入すると小胞体に到達し、シャペロン蛋白質であるBiPを切断することで小胞体ストレスを惹起する。応募者は、SubABが細胞毒性を示すだけでなく、小胞体ストレスを介して宿主の自然免疫を破綻させ、宿主内の生存を高めることを見出した。しかしSubABが宿主の獲得免疫に及ぼす影響は不明である。そこで本研究では、SubABが宿主獲得免疫にどのような影響を調べる。
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| 研究実績の概要 |
Subtilase cytotoxin (SubAB)は、腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）O113:H21株から同定された毒素で宿主細胞の小胞体（ER）のシャペロン蛋白質BiPを切断することで宿主細胞にERストレス性の細胞死を誘導する。わが国でもSubABを産生するEHECが分離されているが、感染病態におけるSubABの病原性は不明である。
申請者は以前、SubABがマクロファージにおいてリポ多糖（LPS）誘導性の誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の発現およびNO産生を抑制することで大腸菌の生存を亢進することを見出した。さらに、SubABは宿主感染防御機構であるインフラマソームとそれによるインターロイキンの産生を抑制し、腸管病原性細菌の感染が増悪化することを報告した（Tsutsuki H. et al,2022）。本研究では、SubABの新しい病原性発現機構の解明を目指し、自然免疫や獲得免疫などに関わる様々な生体防御機構、赤血球や白血球に及ぼすSubABの影響などを包括的に解明することを目的としている。本年度はマクロファージにおけるインフラマソームの活性化解析およびサイトカイン発現解析を行った。また、SubABのantibody dependent enhancement (ADE) 効果の機序解明に向けてSubABとイムノグロブリンの相同性に焦点を当てた。特に、BLAST解析によりSubABのAサブユニットのアミノ酸配列に存在するイムノグロブリン相同アミノ酸配列の探索を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マクロファージにおけるサイトカイン（IL-17など）の発現解析が難航しており時間を要したためやや遅れていると判断した。一方、ADE効果の機序解明に向けてSubABとイムノグロブリンの相同性解析に焦点を当てた。特にBLAST解析の結果、SubABのAサブユニットにイムノグロブリンH鎖と一部相同なアミノ酸配列が存在する可能性が示唆された。これはSubABがBiP(Binding immunogloblin Protein)を基質として認識し切断する理由の解明に重要であると考え、R5年度は実験系の樹立、解析法の開発に注力してきた。現在、SubABに対する抗血清を作製し、さらに詳細な解析を目指している。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒスチジンタグを融合した組換えタンパク質SubABを精製した。これを抗原としてウサギに免疫し抗血清を得た。現在、抗血清をイムノグロブリンに部分精製を行っている。今後、得られた抗体標品を用い、SubABに対する抗体がSubABの毒性を阻害するか、あるいはADEを示すかを検証する。また、SubABを培養細胞に処理し、細胞内侵入や細胞内動態を可視化するための免疫染色用抗体ツールとして使用する予定である。今後、本抗体を用いた免疫沈降法など、Aサブユニットと宿主タンパク質の相互作用（特にSubABのBiPに対する結合や切断作用）について詳細に解析予定である。
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