| 研究課題/領域番号 |
23K08697
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56020:整形外科学関連
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
西谷 江平 京都大学, 医学研究科, 助教 (70782407)
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| 研究分担者 |
吉富 啓之 京都大学, 医学研究科, 准教授 (50402920)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2023年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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| キーワード | 変形性関節症 / 軟骨細胞 / シングルセル解析 / エンハンサー / GWAS |
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| 研究開始時の研究の概要 |
全ゲノム関連解析の一塩基多型 (SNP)をシングルセルRNAseq解析での転写性エンハンサーと共に解釈し、変形性関節症に関連する機能的SNP-転写性エンハンサーを探る。このSNP領域に対してCRISPR技術を用いて軟骨細胞や疾患動物モデルでのエンハンサー遺伝子の発現調節を行い、軟骨細胞の恒常性や基質産能、脱分化に対する影響を検討する。新たなアプローチでの変形性関節症の病態の解明が期待される。
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は様々な手法の融合により、エンハンサー領域の変形性関節症病態への関与を明らかにすることである。これまでに変形性膝関節症患者から採取した軟骨細胞のシングルセルRNAseq解析を４例に、正常膝から採取した軟骨細胞のシングルセルRNAseq解析を３例に行うことができた。軟骨細胞のクラスタリングを行い、主要な発現遺伝子からアノテーションを行い、既知のクラスターであるhomeostatic chondrocyte、regulatory chondrocyte、reparative chondrocyte、hypertrophic chondrocyte、fibrocartilage chondrocyte、proliferative chondrocyte、pre-fibrocartilage chondrocyte、cartilage progenitor chondrocyteの他に過去に報告されていないクラスターも見つかっており、新規クラスターの候補として検討を進めている。また正常膝と変形性膝関節症の軟骨細胞の間でのDEG (Differentially Expressed Genes)についても検討を行っている。現時点で複数個のGWAS-SNPとシングルセルRNAseq解析でのエンハンサーの発現のオーバーラップが確認されており、機能的SNPの候補であると考えている。軟骨細胞のセルラインであるTC28a2に対して、CRISPR技術を用いてエンハンサーを抑制、活性化する技術についても準備が進んでおり、１つのエンハンサーに対して介入を開始しており、エンハンサー遺伝子の発現調節によりSOX９やCOL2、ACANなどの恒常性に関するmRNA発現が変化することを確認されている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度の目標であった変形性膝関節症患者から採取した軟骨細胞のシングルセルRNAseq解析を実施したほか、正常膝関節からも３例のシングルセルRNAseq解析を実施できた。TC28a2を用いて転写活性化因子または転写抑制因子を融合したCRISPRaまたはCRISPRiによる、エンハンサーの活性化または抑制を介した遺伝子発現調節もすでに開始できている。以上のことから初年度の目標としてはほぼ達成できていると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
変形性膝関節症、正常膝関節のシングルセルRNAseq解析を進め解析細胞数を増やし、GWAS-SNPとシングルセルRNAseq解析でのエンハンサーの重なりの検討を継続していく。すでに強い機能的エンハンサー候補として挙がっているものから、CRISPRを用いたエンハンサーへの介入を行っていく。Primary軟骨細胞に対してのCRISPRを用いたエンハンサー遺伝子の発現調節についても試みる予定である。
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