卵細胞質機能低下に起因する妊孕性低下の治療法の開発に向けた基礎的検討

• 研究課題/領域番号: 23K08842
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分56040:産婦人科学関連
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 深澤 宏子 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (60362068)
• 研究分担者: 平田 修司 山梨大学, 大学院総合研究部, 医学研究員 (00228785)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2025年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2024年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2023年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: 卵細胞内 ATP 局在 / ミトコンドリア分布 / 加齢卵 / 細胞質機能 / ミトコンドリア

研究開始時の研究の概要

妊孕性の維持にはミトコンドリアの分配、その結果としてのミトコンドリアの正常な分布が重要であると考えられる。MII 卵細胞内のミトコンドリアの分布と ATP 産生部位に着目し、ミトコンドリアの活性化状況を評価する方策を構築する。また、発生能が低下しているとされる加齢卵や、凍結融解 MII 卵、体外成熟培養卵などの細胞質内のミトコンドリア活性状況の比較検討を行い、細胞質機能異常と発生能との関わりを明らかにする。

研究実績の概要

MII 卵細胞内のミトコンドリアの分布と ATP 産生部位の発生能との関わりを明らかにする目的で、まず、卵細胞内の ATP 産生部位を蛍光観察する方法の構築に着手した。
卵細胞内のミトコンドリアの活性を、細胞内あるいはミトコンドリア内の ATP の局在を観察することで解析する系を確立するために、ATP にリガンドとして結合する蛍光タンパク (MaLion R と MaLion G) をコードした mRNA を合成した。具体的には、ミトコンドリア移行シグナルを N 末端につけた MaLion G をコードする mRNA を合成するための、in vitro transcription vector の作成から開始した。また、MaLion R をコードする mRNA 合成用の vector の作成も行なった。この vector の作成に時間を要したが、目的とする mRNA が合成できた。8 ~ 10 週齢の B6D2F1 メスマウスを過排卵処理して MII 卵を採取し、卵細胞内に上記 mRNA をマイクロピペットを用いて顕微注入してタンパクを発現させ、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。注入する mRNA の濃度が低いと観察に適さず、高すぎると、顕微注入により卵細胞の生存率が下がること、注入した mRNA からタンパクが作られ、観察に適するまでに要する時間は最低でも2、3時間は必要であることなどが明らかとなった。ミトコンドリ移行シグナルをつけた mRNA (Malion G) を注入した卵子では、ミトコンドリアに一致して蛍光が、MaLion R をコードする mRNA を注入した卵子では細胞質に均一に蛍光が確認できたため、目的通りの観察が可能と判断した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

細胞内の ATP 局在とミトコンドリア内の ATP 局在を分けて観察をするためにそれぞれ別の mRNA を合成する必要があり、その in vitro transcription vector の作成に時間を要した。２種類作成したが、別の蛍光色素を使ったものも必要となるため、現在その vector の作成を試みている。先行して作成した vector で合成した mRNA を用いた実験系は確立できたため、前述した検討は開始している。

今後の研究の推進方策

卵細胞内の ATP 産生部位を蛍光観察する方法は確立できたため、卵子の活性化に伴い卵細胞質内での ATP 産生部位やミトコンドリア内での ATP 産生がどのように変化するかを検討する。また、われわれのこれまでの検討で、採卵から 24 時間経過した in vitro aged 卵は ２ 細胞以上には発生しないことがわかっており、将来の臨床応用を見据えて加齢卵のモデルとして、この in vitro aged 卵における細胞内、ミトコンドリア内の ATP 産生を観察する。高齢マウスから得た MII 卵における ATP 産生の変化も観察することを検討している。