| 研究課題/領域番号 |
23K08869
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56040:産婦人科学関連
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
若井 拓哉 岡山大学, 環境生命自然科学学域, 准教授 (60557768)
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| 研究分担者 |
杉村 智史 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (00728454)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | 初期胚 / 染色体異常 / ミトコンドリア / 活性酸素 / 酸化ストレス / 微小核 / 加齢 / 不妊 / 染色体 / マウス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、初期胚において染色体異数性の主要因となる微小核に着目し、その形成メカニズムの解明に取り組む。卵母細胞や初期胚の染色体異常は、母体の加齢に伴い増加することが広く知られている。本研究では、加齢マウスのモデルとして利用し、初期胚における細胞小器官ミトコンドリアに着目した。「ミトコンドリアの機能不全やそれに伴う活性酸素種(ROS)の増加が微小核形成の一要因となる」と仮説を立て、マウスおよびウシ胚を用いて検証する。本研究成果は、体外受精胚における良好胚の予測やヒト着床前検査法の改良に貢献する可能性がある。
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| 研究実績の概要 |
卵母細胞や初期胚の染色体異常は、母体の加齢に伴い増加することが広く知られている。本研究では、初期胚において染色体異数性の主要因となる微小核に着目し、その形成メカニズムの解明に取り組む。これまでの研究から、加齢雌マウスの初期胚ではミトコンドリアが染色体周囲に過剰に集積する現象が確認されている。そこで、局在が異常化したミトコンドリアの機能不全やそれに伴う活性酸素種(ROS)の増加が、染色体不安定性と微小核形成の一要因となる」と仮説を立てた。
2023年度は、12～14か月齢のマウスから採取した加齢胚のミトコンドリア機能を解析した。ミトコンドリア膜電位をTMRM染色、また細胞内およびミトコンドリア内ROSレベルを、それぞれH2DCFDA染色とMitoSOX染色により評価した。加齢胚のミトコンドリアは、若齢胚と比較して凝集サイズの増加が観察されたが、TMRM染色による蛍光輝度に有意な差は認められなかった。一方、H2DCFDA染色による細胞内ROSレベルも加齢胚で有意な変化がみられなかったが、MitoSOX染色では凝集したミトコンドリアに顕著なROSの集積が観察された。これらの結果から、加齢に伴い顕著なミトコンドリア機能の低下はみられないものの、ミトコンドリアにおける局所的なROSの増加が起こる可能性が示唆された。
また、着床前発生過程でのROSレベルの時空間的変化を解析するために、遺伝子コード型の蛍光プローブの使用を検討した。これまでに、酸化還元感受性GFP(roGFP)やHyper7などの異なる蛍光プローブの発現ベクターを構築した。今後はそれぞれのmRNAを合成し、初期胚における発現の観察とROSプローブとしての有用性を検討する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予想に反して、加齢胚における顕著なミトコンドリア機能の低下はみられなかったが、ミトコンドリアにおける局所的なROSの増加が観察された。また、今後の実験で重要な解析ツールとなる遺伝子コード型の蛍光プローブの準備は順調に進んでいる。一方で、今後は人為的にROSを産生させた条件下で染色体の動態をライブセルイメージングにより解析し、微小核形成に及ぼす影響を解析する予定だが、ROS産生を効果的に誘導する実験系の確立に苦心している。
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| 今後の研究の推進方策 |
ROSが微小核形成に及ぼす影響を検討するために、現在は過酸化水素水（H2O2）を添加した培養液で初期胚を培養し、染色体を観察しているが、H2O2処理によるROSレベルの上昇に安定的な結果が見られないことや、高濃度のH2O2処理が胚発生能を著しく阻害することから、最適な実験系とは言い難い。また本研究ではミトコンドリアにおける局所的なROSの誘導を検討しているため、今後は光誘導型のROS産生蛍光タンパク質プローブであるSuperNovaやKillerOrange（Red）の利用を検討している。ミトコンドリア局在化配列を付加したこれらの蛍光タンパク質を受精卵に発現させ、光照射により染色体周囲のミトコンドリア特異的にROS産生を誘導させることで、加齢胚におけるミトコンドリアやROSの特性を再現した実験が可能となる。
一方で、ROSと微小核形成の関連が明らかにされた場合、ROSの軽減が加齢胚の微小核形成を抑制できるか検証を行う予定である。近年、Mito-QやBGP-15などのミトコンドリアを標的とした抗酸化剤が開発され、一般的な抗酸化剤よりもミトコンドリアで発生するROSを消去する可能性が高いため、多くの老化モデルで研究されている。そこで、初期胚におけるこれら治療薬の有効性を検討する予定である。
マウスと比較して、ヒト胚では微小核形成が高頻度で観察されるが、ヒト受精卵の研究は倫理的に取り扱いが難しいことから、ウシ胚の利用を検討している。ウシ胚は紡錘体形成の仕組みや異数性胚の頻度などヒト胚との類似点が非常に多く、ヒト胚のモデルとして有用である。研究分担者の杉村らはウシ胚のライブイセルメージング手法を確立しており、今後はマウスで得られた知見をウシ胚に利用し、ウシ胚の解析も推進する。
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