| 研究課題/領域番号 |
23K09018
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56060:眼科学関連
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
大西 暁士 立命館大学, 総合科学技術研究機構, 教授 (70569102)
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| 研究分担者 |
清成 寛 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40721048)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2025年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2024年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 網膜色素変性 / EYS / ゲノム編集 / オポッサム / 視細胞 / 色素上皮層 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
オポッサム受精卵にCas9ゲノム編集によりEYS遺伝子にInDel変異を導入し、出生個体の殆どが機能ドメインの大半を欠損するノックアウト（KO）遺伝子型を示したので、KO個体作製を継続しつつ以下研究を実施する。①野生型およびEYS KOオポッサム網膜の組織化学的比較解析より、EYS分子局在および視細胞変性への作用機序を明らかにする。②ヒトEYS変異を持つオポッサムを作製し、網膜変性過程・変異EYS分子局在の比較解析より、変異EYS分子の網膜色素変性病態に対する作用機序を明らかにする。③オポッサム網膜（野生型・変異型）のRNA-seqによる解析より、EYS分子の補填機構を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
網膜色素変性（RP; Retinitis Pigmentosa）は、外界の視覚情報を受容する網膜・視細胞が変性する進行性の遺伝性疾患であり、日本人の原因遺伝子の第1位はEYS（Eyes shut homolog）遺伝子である。他国でも多くのEYS変異患者が報告され機能解析・治療製剤開発が待たれるが、EYS研究の進捗は他の原因遺伝子に比して極めて漸進的である。要因として、EYSは3000アミノ酸超の細胞外に局在する巨大分子で実験全般に技術を要する事、遺伝子改変解析に汎用され且つ眼科学的検査手法が確立されているマウス（齧歯類）がEYSを持たない事、の2点が挙げられる。我々は、EYS遺伝子を持つ哺乳類で、マウス・ラットと同じ設備で飼育可能なハイイロジネズミオポッサムにおいてゲノム編集よるEYS欠損個体を作出し、発症原理を解明を目指す。
本年度は表現型解析を中心に研究を進めた。WTのオポッサム網膜では他の生物で報告されているように、視細胞のCiliary pocket部分に強いEYS免疫染色シグナルを認め、また、視細胞のCalyceal process、外節部分、リボンシナプスにもEYS抗体由来シグナルが検出された。SpCas9を介したF0ノックアウトでは、生後半年程度より眼底像に進行性のRPEの色素脱失を認めた。これを裏付ける所見として、EYS KOオポッサム網膜の組織染色において、RPE/脈絡膜・神経網膜層の菲薄化を認めた。透過型電子顕微鏡による超微細構造観察より、EYS KOの錐体・杆体視細胞に外節円板膜に変質構造を認めた。Ciliary pocketやCalyceal processにも構造変容を認めたが、他の生物種による報告と異なる傾向を示した。免疫組織化学的解析の結果、外節蛋白質の異所性局在と、染色シグナルの低下が明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
EYS変異オポッサムにおいて網膜色素変性の病態遷移過程を観察することができ、その疾患進行を裏付ける表現型を免疫組織化学的・組織構造学的手法より検出できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き計画通りに研究を進め、分子作用機序の解析のために抗体作製を検討する。
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