| 研究課題/領域番号 |
23K09023
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分56060:眼科学関連
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
岩川 外史郎 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (30638648)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2025年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2024年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | 虚血性網膜症 / ヒストン修飾 / 遺伝子発現制御 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
虚血性網膜症は低酸素状態に起因する病的血管新生が疾患に深く関わっている。様々な生命現象においてヒストン修飾による遺伝子発現制御の関与が示されているが、網膜血管の病的血管新生が進行している網膜組織において、ヒストン修飾がどのような役割を持つかはほぼ不明である。本研究では、虚血性網膜症のモデルであるoxygen-induced retinopathyマウスから、網膜を構成する様々な細胞集団を分取し、遺伝子発現とヒストン修飾の網羅的な解析やヒストン修飾酵素に対する阻害剤の評価から、ヒストン修飾がどのような遺伝子群の発現制御に関わり病態に寄与しているかを明らかにし、新たな治療標的の探索を試みる。
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| 研究実績の概要 |
令和5年度の主な目標は、CUT&Tagで解析可能な細胞集団の特定とOxygen-induced retinopathy (OIR)マウス網膜と対象マウス網膜を用いたRNA-seqおよびCUT&Tagによる遺伝子発現とヒストン修飾の網羅的解析であった。まず、網膜を構成する細胞集団の中から、これまで単離を試みたことがなかった血管内皮細胞、周皮細胞、アストロサイトに関してFluoresence activated cell sorting (FACS)による単離を試みた。目的細胞を得るための抗原として、CD31, CD140b, ACSA-2を選択し、FACSで分取した後にRT-qPCRを行い目的細胞集団の純度を見積もることとした。血管内皮細胞に関してはCD31によってある程度の純度を伴って分取可能であることが示されたが、周皮細胞とアストロサイトに関しては、純度が低く、目的細胞を十分濃縮されているとは言えない結果となった。
次に、OIRマウスと対象マウス、血管新生を抑えることが示されているVEGFA阻害剤投与マウスから、網膜全体と網膜色素上皮を含む細胞集団に分けてRNA-seqを行い、遺伝子発現の網羅的解析を行なった。その結果、対象マウス網膜と比較するとOIRマウス網膜で免疫や細胞接着に関連した遺伝子の発現が上昇し、それらがVEGFA阻害剤投与によって抑えられることが示唆された。また興味深いことに、OIRマウスの網膜色素上皮を含む細胞集団では、視細胞関連遺伝子の発現が上昇しており、ヒストン修飾などによる遺伝子発現制御が動的に変化している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和5年度では、血管内皮細胞、周皮細胞、アストロサイトを網膜から単離することを目指したが、周皮細胞とアストロサイトに関しては十分な純度で単離することができず、OIRマウス網膜に対するCUT&Tagの解析は達成されたなかったため、やや遅れていると言える。OIRマウス網膜や対象マウス網膜、VEGFA阻害剤投与網膜を用いて、網膜全体や網膜色素上皮を含む細胞集団に関するRNA-seqを実施し、網羅的な遺伝子発現解析を行なった。その結果、免疫や炎症、細胞接着など様々なパスウェイに関連する遺伝子がOIRマウス網膜において発現を変動させており、それらの変動にヒストン修飾などのエピジェネティックな遺伝子発現制御が関与している可能性が示唆された。
OIRマウスに対する解析技術の改善として、新たな抗体を用いることで、網膜flat-mountの免疫染色によってマイクログリアを観察する技術の改善が図られ、より鮮明な染色画像が得られるとともに形態の定量的な解析が可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
十分な純度を伴った単離が達成されていない周皮細胞とアストロサイトに関しては、抗体染色条件の最適化や別の抗原を標的とすることで単離を試みる。
OIRマウスの網膜全体や網膜色素上皮を含んだ細胞集団に対するRNA-seqは実施されたので、次は、FACSにより細胞集団を絞ってRNA-seqやCUT&Tagを行い、遺伝子発現とヒストン修飾の網羅的な解析を実施することで、令和6年度の主な目標である、ヒストン修飾により遺伝子発現制御を受けている遺伝子群の抽出を試みる。
OIRマウスの網膜色素上皮を含んだ細胞集団では、予想外に視細胞関連遺伝子の発現上昇が示唆された。これらの発現変動に対するヒストン修飾の関連や、発現変動の生物学的な意義を明らかにしていく。
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