| 研究課題/領域番号 |
23K09352
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57060:外科系歯学関連
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
村瀬 友里香 岡山大学, 大学病院, 助教 (70803708)
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| 研究分担者 |
滝川 正春 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (20112063)
久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (90221936)
青山 絵理子 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (10432650)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)
2025年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | CCN2 / Rab14 / 軟骨 / 小胞輸送 / ERファジー |
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| 研究開始時の研究の概要 |
顎顔面骨の形成において重要な内軟骨性骨化の分子メカニズムは、未だに十分解明されているとは言えない。
本研究では、内軟骨性骨化過程において、①CCN2が欠損することで軟骨細胞内に蓄積するタンパク質の実体、②CCN2が軟骨細胞内でRab14と結合・協同して、細胞外基質(ECM)の分泌と細胞内タンパク質の分解を制御するメカニズムを解明する。
このメカニズムを解明できれば、内軟骨性骨化の障害に伴う疾病の原因・病態究明、治療法開発への貢献が期待できる。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、内軟骨性骨化過程において、①CCN2が欠損することで軟骨細胞内に蓄積するタンパク質の実体、②CCN2が軟骨細胞内でRab14と結合・協同して、細胞外基質(ECM)の分泌と細胞内タンパク質の分解－タンパク質の恒常性を制御するメカニズムを解明する。
本年度の計画は、CCN2が欠損することで、成長板軟骨細胞内に蓄積するタンパク質の実体を調べること、小胞輸送能が低下しているかを調べること、ER-to-lysosome-associated degradationの最終段階であるリソソームにおける分解が低下しているかを調べることであった。
CCN2ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスの成長板軟骨組織から、解析に必要十分量の軟骨細胞を単離・準備できず、CCN2が欠損することで成長板軟骨細胞内に蓄積するタンパク質の実体を解析するに至らなかった。
CCN2ノックダウン軟骨細胞において、ゴルジ体ストレス応答の標的遺伝子の発現が亢進するかを調べたが、結果のばらつきが大きく、結論を出すに至らなかった。今後は、CCN2ノックアウト軟骨細胞においても検証する予定である。
CCN2ノックダウン軟骨細胞において、オートファジーフラックスアッセイを行い、オートファゴソーム形成マーカーLC3の蓄積が亢進しているかを調べたが、バックグラウンドが高く、細胞染色法のみでは結論を出すに至らなかった。今後は、Western blot法でも解析を行う予定であり、またCCN2ノックアウト軟骨細胞でも検証する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウスの成長板軟骨組織から単離した初代培養軟骨細胞を用いる実験が進められず、軟骨細胞株を用いる実験に偏りがちである。
想定外の診療業務による実験の中断、研究実施場所の工事・変更、ロシア・ウクライナ情勢に伴う物流の停滞・輸送の遅延により実験日程を立てることが困難で、一部の実験は着手することも困難であった。
以上より、進捗状況はやや遅れていると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. ラット軟骨細胞様細胞株RCSを親株として、CCN2ノックアウトRCSを作製する。
2. CCN2ノックアウト軟骨細胞内に蓄積するタンパク質の実体を調べる。
3. CCN2ノックアウト・ノックダウン軟骨細胞において、ECMの分泌と細胞内タンパク質の分解が低下しているかを調べる。
4. CCN2がRab14と結合して、ゴルジ体－エンドソーム間の小胞輸送を担うかを調べる。
5. CCN2がRab14と結合して、オートファゴソームとリソソームの融合を仲介するかを調べる。
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