| 研究課題/領域番号 |
23K09418
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分57070:成長および発育系歯学関連
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
高山 扶美子 九州大学, 大学病院, 助教 (20795950)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
中途終了 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2024年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2023年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
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| キーワード | AmeloD / Smyd3 / RNAシークエンス解析 / エナメル質形成不全 / Eカドヘリン / 歯の発生 / エナメル質 / シングルセルＲＮＡシークエンス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
AmeloDはエナメル芽細胞前駆細胞である内エナメル上皮に発現し、細胞間結合分子Eカドヘリンの転写抑制を行うことで、細胞遊走能を促進し、歯胚の形態を制御することが知られているが、その詳細な分子機構は未だ不明である。我々は、酵母two-hybrid法を用い、マウス歯胚cDNAライブラリのスクリーニングを行い、AmeloDと相互作用する未知のタンパク質を検索した。その結果、ヒストンメチル基転移酵素であるSmyd3を検出した。本研究は、AmeloDと相互作用するsymd3の機能解析を行うことで歯胚形成のメカニズムを探索することを目的とする。
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| 研究実績の概要 |
酵母two-hybrid法およびシングルセルRNAシークエンス解析を用い、マウス歯胚cDNAライブラリをスクリーニングすることで、AmeloDと相互作用する未知のタンパク質を検索した。その結果、ヒストンメチル基転移酵素であるSmyd3(SET And MYND Domain Containing 3)を検出した。すなわちヒストンメチル基転移酵素であるSmyd3はAmeloDと結合することが示唆された。そこで、AmeloDと相互作用するSymd3の機能解析を行った。まず初めに、歯原性上皮細胞の網羅的遺伝子発現解
析のため,生後1日齢マウス臼歯を用いてシングルセルRNAシークエンスデータ上で解析した。Smyd3は内エナメル上皮(IEE)から前エナメル芽細胞(Pre-am)に発現していることが示唆され、この分布はAmeloDの発現と一致した。
次に、Smyd3とAmeloDとの局在を確認するために、胎生13、14、16日齢と、生後1、3、7、12日齢のマウス歯胚を用いて、AmeloDとSmyd3の免疫染色を行った。胎生16日、生後1、3日齢において、基底膜周囲でその発現を認めた。この局在は、AmeloDの発現分布と一致した。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
4: 遅れている
理由
マウス歯胚でのSmyd3とAmeloDとの局在解析を行った後、SF2細胞を用いてSmyd3の遺伝子発現変化の検討を開始した。歯原性上皮細胞株であるSF2は未分化歯原性上皮細胞の状態で維持することが可能であり、増殖因子などの刺激により分化誘導することが可能である。そこで、SF2細胞にGF刺激を行い、RT-PCRにてAmeloDの発現増加を確認し、Smyd3の遺伝子発現の変化と比較することでAmeloDとSmyd3の相関関係を検討した。しかしながら、TGF-ベータ刺激によるAmeloDの発現誘導にばらつきを認めた。AmeloDの発現量が低値であるため、ばらつきを認めたことから、次にSF2細胞にAmeloDを過剰発現させ、その細胞株を用いてSmyd3の発現量について比較検討を行うこととした。しかし、AmeloDを過剰発現させた細胞株はその増殖能にばらつきがあり、有意な結果が得られていない。そのため、進行が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
SF2細胞を用いてTGF-ベータ刺激によるSmyd3の遺伝子発現変化を確認する。
現在進行中の同解析を継続する。TGF-ベータ刺激を行い、RT-PCRにてAmeloDの発現増加を確認し、Smyd3の遺伝子発現の変化と比較する。前述にあるように、AmeloD過剰発現株を用いてTGF-ベータ刺激による分化誘導を行い、Smyd3の発現を比較する。さらに、SF2細胞にプラスミドによりSmyd3を過剰発現させ、その分化過程におけるエナメル上皮分化マーカーの発現変化を確認する。AmeloDは内エナメル上皮に特異的に発現し、エナメル芽細胞へ分化が進むとその発現が消失する。Smyd3の過剰発現により、SF2細胞の分化過程におけるAmeloDやAmelogenin、Enamelin、Ameloblastinなどの分化マーカーをRT-qPCRにてその発現変化を確認する。また、SiRNA によりSmyd3のノックアウトを行い、同様にその発現変化を確認する。
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