| 研究課題/領域番号 |
23K10887
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分59040:栄養学および健康科学関連
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
藤田 香里 秋田大学, 理工学研究科, 講師 (10633092)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2024年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | 老化 / p53 isoform / 加齢 / p53 / モデルマウス / 加齢性疾患 / 完全ヒト化 p53 マウス / p53 isoforms |
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| 研究開始時の研究の概要 |
我々は、ヒト癌抑制遺伝子 TP53 の isoform のうち、2つの isoform が ヒトの加齢状態で発現変動すること、加齢性疾患発症時にはさらに発現変動を起こすことを報告している。 そこで本研究は、生理的加齢変容から加齢性疾患発症へと続く一連の機序解明のため、このヒト p53 isoform の発現変化を利用し、ヒト TP53 遺伝子をマウス Trp53 遺伝子領域にノックインした完全ヒト化 p53 マウスを開発する。作製したマウスの加齢変容とヒト p53 isoform の発現変化の相関を、各種老化マーカーの発現解析と組織学的手法による組織加齢変性を検証する。
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| 研究実績の概要 |
超高齢化社会の我が国おいて、健康寿命延伸は重要な課題である。課題解決には、生理的加齢変容から加齢性疾患発症への転換となる時期と機序の解明が必要で ある。申請者は癌抑制遺伝子 TP53 の isoform のうち、2つの isoform がヒトの加齢状態で発現変動すること、加齢性疾患発症時にはさらに発現変動を起こすことを報告している。そこで本研究は、生理的加齢変容から加齢性疾患発症へと続く一連の機序解明のため、このヒト p53 isoform の発現変化を利用し、ヒト TP53 遺伝子をマウス Trp53 遺伝子領域にノックインした完全ヒト化 p53 マウスを開発する。作製したマウスの加齢変容とヒト p53 isoform の発現変化の相関 を、各種老化マーカーの発現解析と組織学的手法による組織加齢変性を検証することを目的としている。
R６年度は、BAC (Bacterial Artificial Chromosome : 細菌人工染色体)を用いた置換領域の決定を行った。これは、ヒト TP53 遺伝子は、WRAP53 遺伝子とエクソン1同士が重なる形で逆向きに位置しており、Wrap53 分子は、p53 の転写・翻訳調節を行っているという報告もある。従って、単純にマウス Trp53 遺伝子を ヒト TP53 遺伝子に置換しただけでは、isoform を含めヒト p53 の転写・翻訳調節を再現することができないと予想されため、WRAP53 遺伝子の必要最低限領域 を決定する必要がある。そこでヒト染色体17番p13.1の TP53 及び WRAP53 遺伝子領域が含まれたBAC クローンを用いて、CRISPR-Cas9-λRED 相同組換え法により WRAP53 遺伝子の欠失体と３’非翻訳領域に赤色蛍光タンパク質等を発現させる改変BACの作製を行った。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
4: 遅れている
理由
細菌人工染色体(BAC)の改変に、非常に時間がかかった。これは、大学院生の修士研究課題として、もあるため、より時間がかかった理由である。また、λRED 相同組換え法による相同組換えを数回繰り返したが、なかなか挿入カセットと組み換わっ たBACを取得できなかった。これは、WRAP53領域の長さが20 kbと長いことが原因だと考えており、方針を変えてCRISPR/Cas9システムとλRED 相同組換えとの融合システムに切り替えた。λRED 相同組換法単独よりも、相同組換え頻度が上昇し、全ての改変BACが完成した。
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| 今後の研究の推進方策 |
改変BACは全て完成したので、サザンブロットにて最終確認後、若年及び老齢マウスから採取した肺線維芽細胞にエレクトロポレーション法により改変BACを導入し、Cell sorting後、若年マウス由来肺線維芽細胞と老齢マウス由来肺線維芽細胞でヒトp53 isoformの発現に違いがあるか、をRT-qPCR、ウエスタンブロット法により確認する。その後、マウスES細胞に導入するためのターゲティングベクターへの作製に進む。
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