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Cas9を用いたゲノム編集におけるHDR効率向上に重要な要素の探索

研究課題

研究課題/領域番号 23K13844
研究種目

若手研究

配分区分基金
審査区分 小区分37010:生体関連化学
研究機関広島大学

研究代表者

松本 大亮  広島大学, 医系科学研究科(薬), 助教 (20889381)

研究期間 (年度) 2023-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2024年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
キーワード相同組換え / CRISPR-Cas9 / スクリーニング / ゲノム編集 / 相同性組換え
研究開始時の研究の概要

本研究では、正確な遺伝子編集を可能とするために、相同性組換えを効率よく引き起こすCas9変異体を取得し、その特性評価をすることで、相同性組換えを優先的に引き起こすために必要な要因を特定していく。そのために、遺伝子編集が起こった細胞が生き残るシステムの構築とそれを用いたCas9変異体スクリーニングを行う。得られたCas9の変異箇所やin vitroでの解析によって、相同性組換えを効率良く引き起こすために必要な要素を探索する。

研究実績の概要

これまでに報告されたCas9変異体について相同組換え効率の評価を実施した。その結果、EMX1遺伝子を標的としたsgRNAを用いた際に、eSpCas9, SpCas9-HF1, LZ3Cas9において野生型Cas9と比較して高い相同組換え効率が得られた。これらのCas9変異体にはRuvCIIIドメインにおける変異が共通して見られることを見出した。さらに、これら3つの変異体についてこれまでに開発してきた細胞周期依存的な活性化系を導入した。3種類の標的配列について相同組換え効率をHEK293細胞を利用して評価した。その結果、予想に反してeSpCas9とLZ3Cas9をAcrIIA4-Cdt1やAcrIIA5-Cdt1で細胞周期依存的に活性化しても、相同組換え効率は向上せず、逆に減少する結果となった。一方でAcrIIA4-Cdt1を用いてSpCas9-HF1を細胞周期依存的に活性化させた場合に関しては、相同組換え効率が上昇し、オフターゲット作用も低減することがわかった。さらに標的配列における変異導入率も減少していた。これらの結果から、SpCas9-HF1とAcrIIA4-Cdt1を共発現することによって、正確な遺伝子治療を実現できる可能性が示された。
また、相同組換えを効率よく行う変異体を取得するスクリーニング系も構築し、スクリーニング条件の最適化を実施した。このスクリーニングシステムを利用してCas9変異体の選抜を行った結果、野生型Cas9と比較して相同組換えを誘発できるCas9変異体を取得できた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Cas9変異体における相同組換え効率の違いを発見し、変異箇所によるCas9と標的DNAの相互作用変化と切断後のDNA修復機構の関係性が示唆された。特に、相同組換え効率という点において、標的配列のGC含量によって野生型Cas9の方が有利な場合と、変異体が有利な場合が明確に分かれた。今後はこの結果がなぜ起こったのかという点に着目し、研究を進めていく。
また、スクリーニングによって得られたCas9変異体において、野生型Cas9よりも高い相同組換え効率が得られたことから、この変異体においても詳細なメカニズム解析を遂行する。

今後の研究の推進方策

これまでに見出したAcrIIA4-Cdt1によるSpCas9-HF1活性を制御するシステムを利用することで、in vivoにおける正確な遺伝子ノックインが可能かを評価する。
また、スクリーニング系についても引き続き実施し、得られた変異体がなぜHDR効率を向上させたのかという点についてメカニズム解析を実施する。

報告書

(1件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 研究成果

    (16件)

すべて 2024 2023 その他

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (13件) (うち国際学会 1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] SpCas9-HF1 enhances accuracy of cell cycle-dependent genome editing by increasing HDR efficiency, and by reducing off-target effects and indel rates2024

    • 著者名/発表者名
      Matsumoto Daisuke、Matsugi Erina、Kishi Kanae、Inoue Yuto、Nigorikawa Kiyomi、Nomura Wataru
    • 雑誌名

      Molecular Therapy - Nucleic Acids

      巻: 35 号: 1 ページ: 102124-102124

    • DOI

      10.1016/j.omtn.2024.102124

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] The history of genome editing: advances from the interface of chemistry & biology2023

    • 著者名/発表者名
      Matsumoto Daisuke、Nomura Wataru
    • 雑誌名

      Chemical Communications

      巻: 59 号: 50 ページ: 7676-7684

    • DOI

      10.1039/d3cc00559c

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 高精度ゲノム編集を志向した細胞周期依存的CRISPR活性化システムの検討2024

    • 著者名/発表者名
      松本 大亮
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] CRISPR activationを代替とする細胞内CRISPR-Cas9活性検出手法の確立2024

    • 著者名/発表者名
      岸 果苗、濁川 清美、松本 大亮、野村 渉
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] AAVベクターとSauCas9を利用した細胞周期依存型ゲノム編集の検討2024

    • 著者名/発表者名
      松木 依理奈、岸 彩音、松本 大亮、濁川 清美、野村 渉
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Construction and optimization of screening system for high-precision Cas9 variants2024

    • 著者名/発表者名
      Shahram Ahamadi, Komari Kubota, Daisuke Matsumoto, Kiyomi Nigorikawa, Wataru Nomura
    • 学会等名
      日本薬学会第144年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Increased HDR Efficiency By Cell Cycle-Dependent Regulation of High-Fidelity Cas9 variants2024

    • 著者名/発表者名
      Yuto Inoue, Daisuke Matsumoto, Kanae Kishi, Erina Matsugi, Kiyomi Nigorikawa , Wataru Nomura
    • 学会等名
      International Plant & Animal Genome Conference / PAG 32
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 相同組み換え修復効率の向上を志向したSauCas9による細胞周期依存型ゲノム編集2023

    • 著者名/発表者名
      松木 依理奈、岸 彩音、松本 大亮、濁川 清美、野村 渉
    • 学会等名
      第69回日本生化学会大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] CRISPR-Cascadeサブユニットが形成する細胞内ヘテロ分子会合の解析2023

    • 著者名/発表者名
      木野 晴揮、大木 公義、濁川 清美、松本 大亮、野村 渉
    • 学会等名
      第62回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会 中国四国支部学術大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 細胞周期依存型ゲノム編集のSauCas9への適用と遺伝子デリバリー法の検討2023

    • 著者名/発表者名
      岸 彩音、松木 依理奈、濁川 清美、松本 大亮、野村 渉
    • 学会等名
      第62回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会 中国四国支部学術大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Cas9変異体を組み合わせた細胞周期依存型ゲノム編集法での正確性の向上2023

    • 著者名/発表者名
      松本 大亮、井上 雄翔、岸 果苗、松木 依理奈、濁川 清美、野村 渉
    • 学会等名
      第17回バイオ関連化学シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] CRISPR-Cascade構成分子の細胞内ヘテロ分子会合の解析2023

    • 著者名/発表者名
      大木 公義、木野 晴暉、濁川 清美、松本 大亮、野村 渉
    • 学会等名
      第17回バイオ関連化学シンポジウム
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Evaluation of inhibition of SauCas9 activity by Cdt1-fused anti-CRISPRs2023

    • 著者名/発表者名
      Erina Matsugi, Ayane Kishi, Daisuke Matsumoto, Kiyomi Nigorikawa, Wataru Nomura
    • 学会等名
      日本ゲノム編集学会第8回大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Analysis of CRISPRa inhibition mechanism by anti-CRISPRs regulated by cell cycle progression2023

    • 著者名/発表者名
      Kanae Kishi, Kiyomi Nigorikawa, Daisuke Matsumoto, Wataru Nomura
    • 学会等名
      日本ゲノム編集学会第8回大会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] タンパク質発現レベルの精密な制御によるゲノム編集効率の向上2023

    • 著者名/発表者名
      井上 雄翔、松本 大亮、濁川 清美、野村 渉
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会第17回年会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [備考] 【研究成果】細胞周期を利用したゲノム編集技術の正確性をさらに向上させることに成功

    • URL

      https://www.hiroshima-u.ac.jp/news/81475

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書

URL: 

公開日: 2023-04-13   更新日: 2024-12-25  

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