細胞周期制御に関わる新規寿命関連因子の機能解明

• 研究課題/領域番号: 23K13868
• 研究種目: 若手研究
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 小区分38020:応用微生物学関連
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 島崎 嵩史 名古屋大学, 創薬科学研究科, 助教 (50821998)
• 研究期間 (年度): 2023-04-01 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円); 2024年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円); 2023年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
• キーワード: 分裂酵母 / 経時寿命 / Nnk1 / Nnk1キナーゼ / リン酸化プロテオミクス

研究開始時の研究の概要

過去に新規寿命制御因子の同定を目的として長寿命変異株のスクリーニングが行われ、解析の対象であるnnk1変異株が取得された。全ゲノムシークエンス解析の結果、機能未知の遺伝子nnk1+において変異（nnk1-35変異）が確認され、この変異が長寿命の表現型の原因であることが明らかとなった。nnk1+遺伝子は生育に必須であり、nnk1変異株も高温感受性の表現型を示すが、解析の結果、Nnk1タンパク質が寿命制御だけでなく細胞周期の制御に関与することが示唆された。本研究ではこのNnk1タンパク質の生理学的機能を明らかにし、Nnk1タンパク質による寿命制御および細胞周期制御メカニズムの解明を目指す。

研究実績の概要

本研究では分裂酵母の寿命制御因子であるNnk1タンパク質の機能解析を行なった。Nnk1はキナーゼであるがその基質は未だに同定されていないため、N末端側にGSTタグを付加したNnk1全長タンパク質の過剰発現プラスミドを作製した。このプラスミドを酵母細胞に導入し発現誘導を行なったが、予想に反してNnk1タンパク質の過剰発現が見られなかった。この原因について調べたところ、Nnk1タンパク質のN末端側の配列が分解シグナルとなり過剰発現が抑制されていることが明らかになった。この結果を受けて、Nnk1タンパク質のC末端側のみのプラスミドを作製し発現を試みたところ、問題なく過剰発現することに成功した。また表現型の解析から、Nnk1タンパク質はこのC末端側の配列のみでもキナーゼとしての活性を十分に保持することが確認されている。現在はこの過剰発現プラスミドを用いて、リン酸化プロテオミクス解析やNnk1タンパク質と相互作用する因子の探索を行なっている。またNnk1タンパク質は生育に必須であり、nnk1-35変異株は高温条件において生育不全（TS）の表現型を示すことがこれまでの解析によって明らかになっている。そこで、高温条件においてこのTSの表現型を相補する変異株のスクリーニングを実施したところ、nnk1-35変異を保持した上で高温条件で生育可能な株を複数取得することに成功した。現在、これらの株の全ゲノムシーケンス解析を行なっており、Nnk1タンパク質の機能と関連する因子の特定を目指している。

現在までの達成度

3: やや遅れている

理由

従来の予定通り、GSTタグを付加したNnk1全長タンパク質の発現プラスミドを作製し過剰発現を試みたところ、期待に反して過剰発現が起こらないことが判明した。この原因を特定するために解析を行なったところ、Nnk1のN末端側の配列が何らかの分解シグナルになっているようで、Nnk1タンパク質のC末端側の配列のみでプラスミドを作製し直したところ、十分に過剰発現することに成功した。なお、今回作製したNnk1のC末端側のみの配列で、Nnk1タンパク質のキナーゼとしての機能は保持されていることも確認済みである。以上のように、既に問題点の特定と解消は終えているが、この点について時間を要したため解析が予定よりもやや遅れることとなった。

今後の研究の推進方策

今後は、作製したNnk1-C末端の発現プラスミドを用いて、過剰発現した際のリン酸化プロテオミクス解析やプルダウンアッセイによる相互作用因子の網羅的解析を行う予定である。またこれと並行して、取得された複数のnnk1-35変異株のTS相補株についてもそれぞれ全ゲノムシーケンス解析を実施し、TSの相補に関わる原因遺伝子の同定を目指す。これらの解析から得られたデータの共通項となる因子を絞り込み、Nnk1タンパク質の生理学的機能を明らかにする予定である。