| 研究課題/領域番号 |
23K13915
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分38050:食品科学関連
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
米野 雅大 東京理科大学, 薬学部薬学科, 助教 (40866307)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2025年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2023年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | アスコルビン酸 / ヘパラナーゼ１ / 血管内皮 / 脳梗塞 / グリコサミノグリカン / ビタミン / ヘパラナーゼ / ヒアルロニダーゼ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
血管内腔の糖衣分解は、マクロファージの浸潤を亢進し炎症を増大させる。糖衣損傷は炎症増悪に密接に関与するが、糖衣分解酵素であるヘパラナーゼ1 (HPSE1)とヒアルロニダーゼ1(HYAL1)の有効な活性阻害剤が存在しないことが、糖衣を保護のする上での障壁となっている。本研究では、抗酸化ビタミン類類を用いて脳梗塞急性期におけるHPSE1およびHYAL1遺伝子の発現抑制機構を調べ、より有効な治療標的を探索すると同時に脳梗塞を標的として脳血管関門破綻前の脳血管糖衣保護によるマクロファージの浸潤阻害が脳梗塞急性期の炎症抑制に効果的か検証する。
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| 研究実績の概要 |
本研究では脳梗塞により分解される血管内皮細胞の表面上糖鎖（糖衣）の分解抑制機能を有する化合物の探索と脳梗塞への応用を検討する。本年度はまず、脳梗塞発生時に生じる脳血管内皮糖衣の分解を担うヘパラナーゼ1(HPSE1)の発現を抑制する化合物を探索した。候補化合物は申請時に記載した抗酸化ビタミン類からアスコルビン酸(AsA)およびその誘導体に着目して行なった。
ヒト血管内皮細胞株であるEA.hy926細胞に対して、ヒトHPSE1のプロモーター領域とルシフェラーゼを融合したプラスミドを作成しトランスフェクションした。この細胞を用いてレポーターアッセイにより各種試験化合物を培地中に添加した際のHPSE1遺伝子の発現誘導レベルを測定した。AsAやAsAの６位水酸基をパルミトイル化した6-O-Palmitoyl-AsAは濃度依存的にHPSE1遺伝子のプロモーター活性を有意に抑制した。一方でやAsAのγ-ラクトン環上の２位水酸基にグルコースを付与したAsA配糖体ではHPSE1遺伝子のプロモーター活性に変化は認められなかった。つまりAsAおよび6-O-Palmitoyl-AsAのみにHPSE1遺伝子のプロモーター調節作用があることを明らかにした。
次に脳梗塞モデルマウスを作成しAsAを腹腔内投与したところ、コントロール群と比較して脳梗塞体積の有意な減少が認められた。加えて酸化ストレス除去作用のあるN-Acetyl-L-cysteineをAsAとの併用投与することにより、AsAの脳梗塞体積減少に相加的な効果が得られることが確認された。
次にAsAの炎症に対する作用を検討した。マクロファージ様細胞株であるRAW264.7細胞をリポ多糖（LPS)により活性化した後にAsAを添加刺激すると、TNF-αの合成量が減少することが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請時計画した抗酸化性ビタミン類によるヘパラナーゼ発現制御に関する検討が概ね完了したことから、本研究計画順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
EA.hy926細胞の糖衣を抗ヘパラン硫酸抗体(10E4)を用いて免疫染色を行なった結果、糖衣の存在を確認することができなかった。そこでヒト不死化脳血管内皮細胞であるci18細胞を用いて同様に抗ヘパラン硫酸抗体を用いて免疫染色を行なった結果、細胞表面に糖衣の存在が確認された。そこで次年度はci18細胞を用いてHPSE1の発現に対するAsAおよびAsA誘導体の効果を検討する予定である。in vivoではAsAによる脳梗塞体積の増加抑制効果が認められたが、このメカニズムについても検討をする予定をしている。
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