| 研究課題/領域番号 |
23K15041
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分53010:消化器内科学関連
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
上原 慶一郎 神戸大学, 医学部附属病院, 講師 (70710557)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2024年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
2023年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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| キーワード | ヒトiPS細胞 / 胃分化誘導 / オルガノイド / 空間トランスクリプトーム解析 / 分化誘導 / 胃オルガノイド / 粘膜筋板 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、癌浸潤部で粘膜筋板が修復されていないことに着目し、胃癌における粘膜筋板再形成が破綻していることで浸潤しているメカニズムを考えた。それを証明するために、これまでの申請者の研究でヒトiPS細胞を用いて粘膜筋板を伴った胃オルガノイドを作成したが、どのような細胞から粘膜筋板に誘導されるかは不明であった。本研究では、粘膜筋板の元となる細胞を胃分化誘導の経時的シングルセルRNA-seq解析で明らかにする。そして、胃癌浸潤部で粘膜筋板が再形成されないのは、粘膜筋板形成因子によるものかそれとも筋板の元となる細胞によるものかを臨床検体を用いて明らかにし、胃癌浸潤メカニズムを解明する。
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| 研究実績の概要 |
ヒトiPS細胞から胃分化誘導を行い、ヒトiPS細胞・スフェロイド・胃オルガノイドのそれぞれの経時的な段階とSHHシグナル阻害剤やTGFβ阻害剤を添加した胃オルガノイドをXenium in situを用いて空間トランスクリプトーム解析した。Xenium in situのデータを統計解析ソフトRのシングルセル解析パッケージであるSeuratで解析すると、UMAPでは中心にはSOX2を発現する未分化な細胞集団がみられた。両方向に別れるように細胞集団がみられ、一方では上皮マーカーEPCAMと胃上皮マーカであるTFF2を発現する細胞集団がみられた。その集団と正反対には間葉系マーカーを発現する細胞集団がみられた。間葉系マーカーを発現する細胞集団の一部に、平滑筋マーカーであるACTA2やDESを発現する細胞集団がみられた。その発現をXenium explorerで確認すると上皮下に多く認められ、粘膜筋板と考えられた。Seuratで得られたUMAPを用いて、擬似時間解析を行うと、平滑筋マーカーを発現する細胞集団は、胃上皮細胞集団より擬似時間が高く、上皮の成熟より後に平滑筋が成熟していることが示された。これは、以前申請者が分化誘導で示した通り、上皮が成熟し上皮由来のSHHやTGFβシグナルが上皮下平滑筋の分化に関わっているとして矛盾ないものと考えられた。また、擬似時間解析で粘膜筋板の元となる細胞集団を特定することができ、特異的マーカーの候補を絞ることができた。SHHやTGFβシグナル阻害剤投与のオルガノイドでは、DES陽性の成熟した平滑筋細胞が少数だが、平滑筋の元となる細胞集団は保たれており、平滑筋成熟が抑制されていることが判明した。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
3: やや遅れている
理由
胃オルガノイドを経時的に空間トランスクリプトーム解析し、そのデータを統計解析ソフトRのシングルセル解析パッケージのSeuratやMonocle3を用いて擬似時間解析することで平滑筋（粘膜筋板）の元となる細胞集団のマーカー候補を絞ることができた。その候補となっている遺伝子発現をXenium explorerで確認すると、胃上皮直下に発現が多く認められ、胃オルガノイドの粘膜筋板の元となる細胞として矛盾ない分布と考えられた。また、上皮下の平滑筋分化は上皮の分化に続いて起こっており、上皮由来のSHHシグナルやTGFβシグナルが胃オルガノイドの平滑筋分化に関わっているものとして矛盾しないものと考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
胃オルガノイドの上皮下平滑筋（粘膜筋板）の元となる細胞集団のマーカー候補が絞れたので、その遺伝子の蛋白質の免疫染色を行うことで、経時的に平滑筋に分化していることを確認する。そして、ヒトの胃潰瘍病変部でもそのタンパク質の発現が免疫染色にて亢進していることを示し、潰瘍にて破壊された粘膜筋板の再生が行われていることを確認する。そして、胃癌の粘膜下浸潤で、そのタンパク質の免疫染色を行い、発現の違いで予後やリンパ節・遠隔転移に差があるかを調べ、粘膜筋板の再生が浸潤性の胃癌で予後や転移に影響するかを調べる。
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