| 研究課題/領域番号 |
23K15276
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| 研究種目 |
若手研究
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
小区分53050:皮膚科学関連
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
高島 翔太 北海道大学, 医学研究院, 助教 (60962800)
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| 研究期間 (年度) |
2023-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2024年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2023年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
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| キーワード | 先天性表皮水疱症 / 遺伝子治療 / エクソンスキッピング / 選択的スプライシング |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、COL7の網羅的exon skippingを行い、発現するCOL7の機能や構造の解析によってRDEBの治療標的に最適なexonを全て同定する。遺伝子変異を有するexonをskipする治療研究が進められているが、skipされるexonによっては発現するCOL7の機能が回復せずに治療が失敗する可能性があり、あらかじめどのexonのskipでRDEBの治療が可能かを検討する必要がある。本研究ではRDEBの原因タンパクの構造的かつ機能的理解を深め、適切な治療戦略を決定するデータベースを作成することである。得られるCOL7 exonデータベースによって、RDEBの遺伝子治療戦略を決定する。
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| 研究実績の概要 |
① エクソンスキッピングしたCOL7 cDNA発現ベクターの作成：
本研究を遂行するにあたり、COL7cDNA WTベクターから各種エクソンをスキップしたCOL7 cDNA発現ベクターの作製を行った。ベクターの作製にはKOD mutagenesis kitを用いて行い、大腸菌を用いて形質転換したのち、miniprepで抽出を行った。
② 培養細胞上清を用いたwestern blot：
本研究ではそれぞれのエクソンをスキップした状態でCOL7に機能性があるかを確認する必要がある。COL7は細胞内で三本鎖を形成し、細胞外に分泌して初めて機能を有するため、エクソンをスキップしたCOL7が三本鎖を巻くかどうかtriple-helix formation assayを行う必要があった。しかしCOL7は非常に大きいタンパクであることからWestern blotの手技も非常に煩雑であることが問題であった。今回我々は、細胞外に分泌された培養上清中のCOL7でのwestern blotの手技安定化を図った。
③ エクソンスキップを誘導するsplicing factor、RNA binding proteinの探索
すでに公表されているデータベースや遺伝子配列情報を元に候補となるsplicing factorやRNA binding proteinの探索を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞上清を用いたwestern blotでは上清内に浮遊細胞がわずかに含まれてしまうと、細胞内のCOL7を検出してしまう問題点があり、そのような場合には細胞上清にもb-actinなどのhouse keeping geneもわずかに検出されてしまう。
そのような混入を避けるプロトコルの樹立を目指し現在実験を続けているところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
複数のエクソンをスキップしたCOL7cDNAの培養細胞上清でCOL7の発現を確認できた時点で、splicing factorやRNA binding protein を用いて特定のエクソンをスキップする実験を開始する。
スキップできるエクソンとしてはいけないエクソンを同定することと同時に、病原性のあるバリアントを有するエクソンをスキップするsplicing factorやRNA biniding proteinを同定することで、疾患治療の選択肢ともなりうると考えている。
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