巨大イオンチャネル複合体を用いた新規オプトジェネティクスツール開発

• 研究課題/領域番号: 23K18090
• 研究種目: 挑戦的研究(萌芽)
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 中区分43:分子レベルから細胞レベルの生物学およびその関連分野
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 井上 圭一 東京大学, 物性研究所, 准教授 (90467001)
• 研究期間 (年度): 2023-06-30 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円); 2024年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円); 2023年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
• キーワード: オプトジェネティクス / ロドプシン / ベストロフィン / イオンチャネル / レチナール

研究開始時の研究の概要

本研究では、最近海洋性藻類から見つかった光受容膜タンパク質である、ベストロドプシン（BestRh）を基盤とした、新規オプトジェネティクスツール開発を目的とする。BestRhは中央にベストロフィンドメインが巨大径のチャネルを形成し、周囲のロドプシンドメインによってその開閉が光依存的に制御され、従来のチャネルロドプシン（ChR）を上回るイオン輸送能を持つ。またChRより、遙かに長波長の光へ応答性を示すことから、BestRhを用いることで、脳などの組織による操作光の散乱の影響が少ない、体深部の神経操作も可能になると期待される。そこで本研究では高い機能性を有するBestRhの探索・開発とオプトジェネティクス応用を目指す。

研究実績の概要

本年度は、海洋性の藻類が持つ、巨大光応答型イオンチャネル複合体であるベストロドプシン（BestRh）の機能評価を行うため、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）を用いたタンパク質発現系の構築を試みた。その際にはすでに論文として報告されている分子（TaraRRB）のものとは異なる生物種由来のBestRh遺伝子を選択し、それらの合成遺伝子をP. pastrisの細胞へ導入した。そしてBestRh発現後のP. pastrisの細胞体のロドプシン由来の呈色を見ることで、最終的に良好なタンパク質発現を示す形質転換体を得ることに成功した。さらにタンパク質発現時に添加するall-trans-retinal (ATR)の量を増やすことで、より効率的にATRが発色団としてタンパク質に内部に取り込まれることが明らかとなった。続いてP. pastrisの細胞体をジルコニアビーズで破砕後、界面活性剤でBestRhを可溶化し、それをNiアフィニティークロマトグラフィーで精製することにより、最終的に2 mg程度のタンパク質が得られることが確認された。次に精製されたタンパク質の吸収スペクトルを測定したところ、TaraRRBと同じく赤色光領域に吸収極大波長を示した。さらにpHを変えながら吸収スペクトルの変化を測定したところ、TaraRRBとは異なった形の吸収ピークのシフトを示した。この際には紫外域においても吸収変化が見られたことから、芳香族性のアミノ酸についてもプロトン化状態の変化があると考えられる。今後はさらに詳細なpH変化を測定することで、TaraRRBとの物性の違いを明らかにすることを目指す。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度はP. pastorisを用いたタンパク質発現系を確立したことで、最終年度に向けて今後多様な種由来のBestRを調べる体制が整えられた。またNiアフィニティークロマトグラフィーを用いることで分光計測に十分な量（ミリグラムオーダー）のタンパク質を得ることができており、さらにタンパク質精製後液体窒素で急冷し、-80 ℃下で保管することで測定までに生じるタンパク質のダメージを最小化できることも確認している。また本年度検討を行った以外のBestRについても約20種類の分子について遺伝子配列の収集を完了しており、今後順次これらの物性についても研究を行っていく。

今後の研究の推進方策

今後は本年度確立されたP. pastorisによるタンパク質発現系と、Niアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製系を用いることで、より多様なBestRhについて物性研究を行い、種ごとの多様性や共通性を調べる。またさらに顕著な物性の違いが見られたものについては、部位特異的アミノ酸変異体などを作製することで、その要因となるアミノ酸残基を特定し、分子メカニズムの詳細を明らかにしていく。またBestRhは5量体同士が対向型で結合することにより、10量体構造を形成してしまい、ホ乳類細胞へ発現させた際に形質幕への局在が低下してしまうことが指摘されている。これについても、５量体同士の会合を阻害するアミノ酸変異を相互作用界面へ加えることで回避できると期待され、今後それに関する研究を行っていく。

研究成果

• [国際共同研究] イスラエル工科大学/エルサレム・ヘブライ大学(イスラエル)
• [国際共同研究] シエナ大学(イタリア)
• [国際共同研究] カリフォルニア大学バークレー校/スタンフォード大学/ボーリング・グリーン州立大学(米国)
• [国際共同研究] ストラスブール大学(フランス)
• [国際共同研究] オックスフォード大学(英国)
• [雑誌論文] Cis-Trans Reisomerization Preceding Reprotonation of the Retinal Chromophore Is Common to the Schizorhodopsin Family: A Simple and Rational Mechanism for Inward Proton Pumping (2024)
  • 著者名/発表者名: Taito Urui, Kouhei Hayashi, Misao Mizuno, Keiichi Inoue, Hideki Kandori, Yasuhisa Mizutani
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 128 号: 3 ページ: 744-754
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.3c07510
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Chromophore-Protein Interactions Affecting the Polyene Twist and π-π* Energy Gap of the Retinal Chromophore in Schizorhodopsins (2024)
  • 著者名/発表者名: Taito Urui, Tomomi Shionoya, Misao Mizuno, Keiichi Inoue, Hideki Kandori, Yasuhisa Mizutani
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 128 号: 10 ページ: 2389-2397
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.3c08465
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Light-Gated Cation Channel with High Reactivity to Weak Light (2023)
  • 著者名/発表者名: Shoko Hososhima, Shinji Ueno, Satoshi Okado, Ken-ichi Inoue, Masae Konno, Yumeka Yamauchi, Keiichi Inoue, Hiroko Terasaki, Hideki Kandori, Satoshi P. Tsunoda
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 13 号: 1 ページ: 7675-7675
  • DOI: 10.1038/s41598-023-34687-7
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effects of the Unique Chromophore-Protein Interactions on the Primary Photoreaction of Schizorhodopsin (2023)
  • 著者名/発表者名: Chun-Fu Chang, Masae Konno, Keiichi Inoue, Tahei Tahara
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry Letters 巻: 14 号: 31 ページ: 7083-7091
  • DOI: 10.1021/acs.jpclett.3c01133
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Light-Driven Anion Pump with Two Different Transport Modes (2023)
  • 著者名/発表者名: Manish Singh, Shota Ito, Shoko Hososhima, Rei Abe-Yoshizumi, Satoshi P. Tsunoda, Keiichi Inoue, Hideki Kandori
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 127 号: 32 ページ: 7123-7134
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.3c02116
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural Basis for Color Tuning and Ion Selectivity in Potassium-Selective Channelrhodopsins (2023)
  • 著者名/発表者名: S. Tajima, Y. S. Kim, M. Fukuda, Y.J. Jo, P. Y. Wang, J. M. Paggi, E. F.X. Byrne, K. E. Kishi, S. Nakamura, C. Ramakrishnan, S. Takaramoto, T. Nagata, M. Konno, M. Sugiura, K. Katayama, T. E. Matsui, K. Yamashita, S. Kim, H. Ikeda, M. Inoue, H. Kandori, R. O. Dror, K. Inoue, K. Deisseroth, H. E. Kato
  • 雑誌名: Cell 巻: 186 号: 20 ページ: 4325-4344.e26
  • DOI: 10.1016/j.cell.2023.08.009
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Photochemistry of the Retinal Chromophore in Microbial Rhodopsins (2023)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 127 号: 43 ページ: 9215-9222
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.3c05467
  • 査読あり
• [雑誌論文] Iron-limitation Light Switch (2023)
  • 著者名/発表者名: Oded Beja, Keiichi Inoue
  • 雑誌名: Nature Microbiology 巻: 8 号: 11 ページ: 1942-1943
  • DOI: 10.1038/s41564-023-01491-y
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Multiple Roles of a Conserved Glutamate Residue for Unique Biophysical Properties in a New Group of Microbial Rhodopsins Homologous to TAT Rhodopsin (2023)
  • 著者名/発表者名: Kentaro Mannen, Takashi Nagata, Andrey Rozenberg, Masae Konno, Maria del Carmen Marin, Reza Bagherzadeh, Oded Beja, Takayuki Uchihashi, Keiichi Inoue
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology 巻: 436 号: 5 ページ: 168331-168331
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2023.168331
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Functional Characterization of Four Opsins and Two G Alpha Subtypes Co-Expressed in the Molluscan Rhabdomeric Photoreceptor (2023)
  • 著者名/発表者名: Ryota Matsuo, Mitsumasa Koyanagi, Tomohiro Sugihara, Taishi Shirata, Takashi Nagata, Keiichi Inoue, Yuko Matsuo, Akihisa Terakita
  • 雑誌名: BMC Biology 巻: 21 号: 1 ページ: 291-291
  • DOI: 10.1186/s12915-023-01789-7
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 光を司る分子の技：レチナールの光化学がもたらすロドプシンタンパク質の多様な機能性 (2024)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 2023年度 化学生命工学講演会「化学生命の最前線１」
  • 招待講演
• [学会発表] 液滴形成における神経タンパク質α-synucleinとsynapsinの相互作用機構 (2024)
  • 著者名/発表者名: 宝本 俊輝、井上 圭一
  • 学会等名: 第13回日本生物物理学会関東支部会
• [学会発表] Electrophysiological study of the effect of weak organic acids on the transport activity of proton pumping rhodopsin of rhizobacteria (2024)
  • 著者名/発表者名: Zikun Lyu、Shunki Takaramoto、Maria del Carmen Marin、Hiromu Yawo、Keiichi Inoue
  • 学会等名: 第13回日本生物物理学会関東支部会
• [学会発表] The Photochemistry of Retinal Chromophore and its Biological Role in New Rhodopsins (2024)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: Gordon Research Conference: Photosensory Receptors & Signal Transduction
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] レチナール光異性化酵素ロドプシンの吸収波長特性と可逆的光反応 (2024)
  • 著者名/発表者名: 森本 直也、永田 崇、井上 圭一
  • 学会等名: 日本化学会第104春季年会
• [学会発表] The Rhodopsin Symphony from Nagoya (2023)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: オプトバイオテクノロジー研究センター シンポジウム「光といのち」
  • 招待講演
• [学会発表] 高熱安定性光駆動型内向きH+ポンプロドプシン(MtSzR)の安定化メカニズムの研究 (2023)
  • 著者名/発表者名: 川﨑佑真、今野雅恵、井上圭一
  • 学会等名: 第49回生体分子科学討論会
• [学会発表] 微生物ロドプシンがもたらす光生物学の新地平 (2023)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 東京大学大学院理学研究科物理学専攻談話会
  • 招待講演
• [学会発表] Retinal Chromophore Twisting Regulates Channel Gating of Channelrhodopsin C1C2 (2023)
  • 著者名/発表者名: Keisei Shibata、Kazumasa Oda、Tomohiro Nishizawa、Yuji Hazama、Ryohei Ono、Shunki Takaramoto、Reza Bagherzadeh、Hiromu Yawo、Osamu Nureki、Keiichi Inoue、Hidefumi Akiyama
  • 学会等名: Time Resolved Vibrational Spectroscopy 2023
  • 国際学会
• [学会発表] レチナール光異性化酵素ロドプシンRGRの吸収分光特性と可逆的光反応 (2023)
  • 著者名/発表者名: 森本 直也、永田 崇、井上 圭一
  • 学会等名: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [学会発表] 動物の光受容をささえる光受容タンパク質・ロドプシンの多様性 (2023)
  • 著者名/発表者名: 永田 崇
  • 学会等名: 第34回生体機能関連化学部会若手の会 サマースクール
  • 招待講演
• [学会発表] The role of proton transfer in ion-transporting microbial rhodopsins (2023)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: Biophysical Society (BPS) Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] ゲノム探索がもたらす微生物ロドプシン研究の新視点 (2023)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 第23回日本光生物学協会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 脊椎動物が持つレチナール光異性化酵素ロドプシンRGRの光吸収・反応特性 (2023)
  • 著者名/発表者名: 森本 直也、永田 崇、井上 圭一
  • 学会等名: 第23回日本光生物学協会年会
• [学会発表] カチオンチャネルロドプシンChRmineのイオン輸送メカニズム (2023)
  • 著者名/発表者名: 宝本 俊輝、川﨑 佑真、柴田 桂成、岸 孝一郎、加藤 英明、井上 圭一
  • 学会等名: 第23回日本光生物学協会年会
• [学会発表] レチナール発色団のねじれとプロトン化によるチャネルロドプシンC1C2のチャネル開閉メカニズム (2023)
  • 著者名/発表者名: 柴田 桂成、小田 和正、西澤 知宏、挾間 優治、小野 稜平、寶本 俊輝、Reza Bagherzadeh、八尾 寛、濡木 理、井上 圭一、秋山 英文
  • 学会等名: 第23回日本光生物学協会年会
• [学会発表] Time-resolved Raman spectroscopic study of channelrhodopsins (2023)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: 8th Asian Spectroscopy Conference 2023
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Twisting and Protonation of Retinal Chromophore Regulate Channel Gating of Channelrhodopsin C1C2 (2023)
  • 著者名/発表者名: Keisei Shibata、Kazumasa Oda、Tomohiro Nishizawa、Yuji Hazama、Ryohei Ono、Shunki Takaramoto、Reza Bagherzadeh、Hiromu Yawo、Osamu Nureki、Keiichi Inoue、Hidefumi Akiyama
  • 学会等名: 8th Asian Spectroscpy Conference 2023
  • 国際学会
• [学会発表] 脊椎動物が持つレチナール光異性化酵素ロドプシンRGRの吸収・光反応特性 (2023)
  • 著者名/発表者名: 森本 直也、永田 崇、井上 圭一
  • 学会等名: 日本動物学会 第94回大会
• [学会発表] レチナール発色団のねじれとプロトン化によるチャネルロドプシンC1C2のチャネル開閉制御 (2023)
  • 著者名/発表者名: 柴田 桂成、小田 和正、西澤 知宏、挾間 優治、小野 稜平、寶本 俊輝、Reza Bagherzadeh、八尾 寛、濡木 理、井上 圭一、秋山 英文
  • 学会等名: 第17回分子科学討論会
• [学会発表] Photochemistry behind diverse functions of microbial rhodopsins (2023)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: ICPAC Bali 2023
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光駆動型外向きプロトンポンプ型ロドプシンの内向きプロトンポンプへの機能転換 (2023)
  • 著者名/発表者名: Marin Perez Maria del Carmen、今野 雅恵、八尾 寛、井上 圭一
  • 学会等名: 第17回分子科学討論会
• [学会発表] 光ではたらくタンパク質、微生物ロドプシンの機能物性研究 (2023)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 東京大学物性研究所協議会
  • 招待講演
• [学会発表] ベストロドプシン：ユニークな光反応を示す新奇光駆動陰イオンチャネル (2023)
  • 著者名/発表者名: 今野 雅恵
  • 学会等名: 第61回 日本生物物理学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 高機能性タンパク質のデザインのための機械学習法の開発およびロドプシンの吸収波長制御への応用 (2023)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 第61回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 脊椎動物が持つレチナール光異性化酵素ロドプシン・RGRの吸収波長の多様性 (2023)
  • 著者名/発表者名: 永田 崇、森本 直也、李 春ヤン光、井上 圭一
  • 学会等名: 第61回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 新奇カチオンチャネルロドプシンHulaCCRの機能解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 宝本 俊輝、 Shai Fainsod、永田 崇、Andrey Rozenberg、 Oded Beja、井上 圭一
  • 学会等名: 第61回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 外向きH+ポンプ型ロドプシンから内向きH+ポンプへの機能転換による膜タンパク質のイオン輸送方向決定機構に関する研究 (2023)
  • 著者名/発表者名: Maria Del Carmen Marin Perez、今野 雅恵、八尾 寛、井上 圭一
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第49回討論会
• [学会発表] Saccharibacteriaが持つ、宿主由来のall-transレチナールを利用する外向きプロトンポンプロドプシンの分子特性解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 今野 雅恵、Alexander L. Jaffe、川﨑 佑真、片岡 千尋、Oded Beja、神取 秀樹，Jillian F. Banfield、井上 圭一
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会第49回討論会
• [備考] 東京大学物性研究所・井上研究室
  • URL: https://inoue.issp.u-tokyo.ac.jp/index.html