経頭蓋遺伝子操作法の研究開発

• 研究課題/領域番号: 23K18250
• 研究種目: 挑戦的研究(萌芽)
• 配分区分: 基金
• 審査区分: 中区分51:ブレインサイエンスおよびその関連分野
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 竹内 雄一 北海道大学, 薬学研究院, 准教授 (70588384)
• 研究分担者: 真栄城 正寿 北海道大学, 工学研究院, 准教授 (40744248) ; 上阪 直史 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (70597624)
• 研究期間 (年度): 2023-06-30 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円); 2025年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円); 2024年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円); 2023年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
• キーワード: 超音波 / ソノポレーション / 微小気泡 / 遺伝子導入 / ゲノム編集 / 経頭蓋集束超音波 / マイクロバブル / 脂質ナノ粒子

研究開始時の研究の概要

本研究の目的は、頭蓋外から脳部位特異的な遺伝子導入およびゲノム編集を可能にする経頭蓋遺伝子操作法の創出である。経頭蓋集束超音波照射法、血液脳関門一時開放法、超音波細胞膜穿孔法、およびゲノム編集法の融合により、非侵襲性と空間特異性を両立した遺伝子導入およびゲノム編集を行う。超音波感受性機械受容チャネル遺伝子の経頭蓋導入等により、経頭蓋的神経活動操作も達成する。こうして従来法では成し得なかったオール非侵襲パイプラインで経頭蓋的神経活動操作およびゲノム編集を達成することで、薬物抵抗性脳疾患の革新的治療法の概念実証を達成する。

研究実績の概要

薬物抵抗性脳疾患の制御には、神経活動の直接操作や遺伝子治療が有効である。これまで光遺伝学的神経活動操作で脳疾患モデル動物の症状を制御する研究が多く行われてきた。しかしながら光遺伝学的神経活動操作法には光ファイバーの脳実質への刺入が必要であるため、臨床応用にはその侵襲性が大きな課題であった。
また近年脳疾患を含む遺伝病の治療法としてゲノム編集技術が着目されている。現在の治療戦略はウイルスベクターの全身投与あるいは脳実質への直接投与であるため、空間特異性の欠如あるいは侵襲性がそれぞれ課題である。
そこで本研究では、経頭蓋集束超音波照射法と超音波細胞膜穿孔（ソノポレーション）法およびゲノム編集法の融合により、頭蓋外から非ウイルス性に脳部位特異的な遺伝子導入あるいはゲノム編集を可能にする経頭蓋遺伝子操作法の創出によって、これらの課題を克服することを目的とする。
初年度は、まず経頭蓋集束ソノポレーション法に関して1-10 MHzの中心周波数を検討し、周波数依存的に遺伝子導入の空間的範囲を制御できることを見出した。次に複数の機械受容チャネル分子に関して、そのプラスミド分子の静脈経由および経頭蓋集束超音波照射を組み合わせることで、任意の脳部位に遺伝子導入が可能であることを見出した。さらに培養細胞において、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミドを用いたゲノム編集技術を評価する実験を立ち上げた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究遂行に際して重要な技術的課題である「経頭蓋集束超音波照射法とソノポレーション法による脳部位特異的かつ非侵襲的な遺伝子導入」を既に達成できているため。そのため「おおむね順調に進展している」と判断した。

今後の研究の推進方策

初年度において、プラスミドベクターおよび微小気泡の静脈投与と経頭蓋集束超音波照射法とを組み合わせることで、脳部位特異的かつ非侵襲的な遺伝子導入法の創出に成功するとともに、ゲノム編集の実験系の立ち上げにも成功した。次年度は、当該成果を発展させ、経頭蓋集束ソノポレーション法による遺伝子導入の効率向上、細胞種特異的な遺伝子発現、および経頭蓋ゲノム編集法の研究開発を推進する。
1. 経頭蓋集束ソノポレーション法による遺伝子導入の効率向上：超音波照射の物理的パラメーター（照射出力、デューティ比等）の検討や核酸封入脂質ナノ粒子を導入することで、経頭蓋集束ソノポレーション法による遺伝子導入の効率向上を検討する。
2. 超音波遺伝学素子の経頭蓋的強制発現系の開発：代表的な超音波遺伝学素子である機械受容チャネルPiezoおよびTRP分子を大脳神経細胞に非侵襲的かつ細胞種特異的に導入する技術を開発する。プラスミドのソノポレーションで、アデノ随伴ウイルスベクターに搭載不可能な大サイズ遺伝子の導入が可能になる。神経細胞やグリア細胞に特異的なプロモーターの利用で細胞種特異性を実現する。
3. 経頭蓋ゲノム編集法の開発：初年度に立ち上げた培養細胞系において、Cas9ヌクレアーゼ発現プラスミド、ガイドRNA、およびレポーター遺伝子発現鋳型DNAを標的脳部位の神経細胞に導入し、その効率を評価する。具体的には、まずβ-actinやCaMKIIαのゲノムを標的として標的配列を特異的に切断し、その効率を評価する。次に当該遺伝子に緑色蛍光タンパク質GFPを挿入し、内因性タンパク質を可視化する。

研究成果

• [国際共同研究] ニューヨーク大学(米国)
• [国際共同研究] セゲド大学(ハンガリー)
• [雑誌論文] TRPC6 is a mechanosensitive channel essential for ultrasound neuromodulation in mammalian brain (2024)
  • 著者名/発表者名: Matsushita YM, Yoshida K, Yoshiya M, Shimizu T, Tsukamoto S, Takeuchi Y, Higuchi M, Shimojo M
  • 雑誌名: bioRxiv 巻: 2024
  • DOI: 10.1101/2024.03.06.583779
  • オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 1. Reinstating olfactory bulb derived limbic gamma oscillations alleviates depression. (2023)
  • 著者名/発表者名: Li, Q.*, Takeuchi, Y.*, Wang, J., Barcsai, L., Pedraza, L.K., Kozak, G., Nakai, S., Kato, S., Kobayashi, K., Ohsawa, M., Lorincz, M.L., Devinsky, O., Buzsaki, G. and Berenyi, A. * Equal contribution
  • 雑誌名: Neuron 巻: In press 号: 13 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2023.04.013
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Closed-loop brain stimulation augments fear extinction in male rats (2023)
  • 著者名/発表者名: Sierra RO, Pedraza LK, Barcsai L, Peijin A, Li Q, Kozak G, Takeuchi Y, Nagy AJ, Lorincz ML, Devinsky O, Buzsaki G, Berenyi A
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 14 号: 1 ページ: 3972-3972
  • DOI: 10.1038/s41467-023-39546-7
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Toward non-invasive, precise control of internal organs via ultrasound neuromodulation of the autonomic nervous system (2023)
  • 著者名/発表者名: Xu Y, Yoshida K, Takeuchi Y
  • 雑誌名: Proc SPIE 巻: 12608 ページ: 59-59
  • DOI: 10.1117/12.3008167
  • 査読あり
• [学会発表] A closed-loop sonogenetic control of absence epilepsy (2024)
  • 著者名/発表者名: Yoshida K, Minami M, Takeuchi Y
  • 学会等名: The 101st Annual Meeting of The Physiological Society of Japan
  • 招待講演
• [学会発表] A non-invasive gene transfection technology using transcranial focused ultrasound irradiation (2024)
  • 著者名/発表者名: Mimura T, Chan M, Minami M, Kudo N, Takeuchi Y
  • 学会等名: The 101st Annual Meeting of The Physiological Society of Japan
• [学会発表] Reinstating olfactory bulb-derived limbic gamma oscillations alleviates depression-like behavioral deficits in rodents (2024)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi Y
  • 学会等名: The 101st Annual Meeting of The Physiological Society of Japan
• [学会発表] Reinstating olfactory bulb derived limbic gamma oscillations alleviates depression-like behavioral deficits in rodents (2024)
  • 著者名/発表者名: Li Q, Takeuchi Y, Wang J, Gellert L, Barcsai L, Pedraza LK, Nagy AJ, Kozak G, Nakai S, Kato S, Kobayashi K, Ohsawa M, Horvath G, Kekesi G, Lorincz ML, Devinsky O, Buzsaki G, Berenyi A
  • 学会等名: The 2nd International Symposium Hyper-Adaptability
  • 国際学会
• [学会発表] Transcranial sonoporation technology for non-invasive gene transfection (2023)
  • 著者名/発表者名: Mimura T, Chan M, Minami M, Omata D, Suzuki R, Takeuchi Y
  • 学会等名: The 150th Annual Meeting of the Hokkaido Branch of the Pharmaceutical Society of Japan
• [学会発表] A closed-loop transcranial ultrasound irradiation system for an awake rat model of absence epilepsy (2023)
  • 著者名/発表者名: Yoshida K, Minami M, Takeuchi Y
  • 学会等名: The 46th Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society
• [学会発表] Non-invasive gene transfection to neurons in the cortex using transcranial ultrasound irradiation (2023)
  • 著者名/発表者名: Chan M, Mimura T, Minami M, Takeuchi Y
  • 学会等名: The 46th Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society
• [学会発表] A neural basis of decision-making when faced with contradictory predictions of reward and punishment (2023)
  • 著者名/発表者名: Yoshida K, Chan M, Minami M, Takeuchi Y
  • 学会等名: CogFeel@ALIFE2023
  • 国際学会
• [学会発表] Non-invasive, spatiotemporal control of internal organs via sonogenetic stimulation of the autonomic nervous system (2023)
  • 著者名/発表者名: Yoshida K, Xu Y, Mimura T, Chan M, Kudo N, Minami M, Takeuchi Y
  • 学会等名: JNNS2023
• [学会発表] Toward non-invasive, precise control of internal organs via ultrasound neuromodulation of the autonomic nervous system (2023)
  • 著者名/発表者名: Xu Y, Yoshida K, Takeuchi Y
  • 学会等名: 9th Biomedical Imaging and Sensing Conference. Yokohama, Japan
  • 国際学会 / 招待講演
• [備考] researchmap
  • URL: https://researchmap.jp/ytake/
• [備考] 個人ウェブサイト
  • URL: https://ytake.org/
• [備考] 研究グループウェブサイト
  • URL: https://ytakelab.notion.site/