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卵巣癌腹膜微小環境を突破する新規CAR-T細胞療法の確立

研究課題

研究課題/領域番号 23K18326
研究種目

挑戦的研究(萌芽)

配分区分基金
審査区分 中区分56:生体機能および感覚に関する外科学およびその関連分野
研究機関名古屋大学

研究代表者

山北 由彦  名古屋大学, 医学系研究科, 客員研究者 (70639583)

研究分担者 梶山 広明  名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (00345886)
吉原 雅人  名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (00878374)
富田 弘之  岐阜大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (50509510)
小屋 美博  名古屋大学, 医学系研究科, 特任講師 (80396960)
研究期間 (年度) 2023-06-30 – 2026-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
2025年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2024年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
2023年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
キーワード卵巣癌 / CAR-T療法 / 腹水 / 卵巣がん / 癌性腹膜炎
研究開始時の研究の概要

「キメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞療法」(CAR-T療法)が実用化され、造血器腫瘍における劇的な治療効果から大きな注目を集めている。しかしながら固形腫瘍におけるCAR-T療法の治療効果は限定的であり、治療法の更なる改善が求められている。特に卵巣がん患者の腹腔内環境は、高度に免疫抑制状態にあることが報告されており、その要因の一つにがん性腹膜炎に伴う腹水の存在が挙げられる。本研究ではヒト臨床検体サンプルとゲノム編集技術を用いた機能遺伝子のゲノムワイドスクリーニング法を用いて、免疫抑制環境を解除する遺伝子を同定し、卵巣がんの腹腔内微小環境において有効な新規CAR-T遺伝子改変手法を開発する。

研究実績の概要

キメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptor; CAR)を応用した「キメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞療法」(CAR-T療法)が実用化され、造血器腫瘍における劇的な治療効果から大きな注目を集めている。しかしながら固形腫瘍におけるCAR-T療法の治療効果は限定的であり、治療法の更なる改善が求められている。特に卵巣がん患者の腹腔内環境は、高度に免疫抑制状態にあることが報告されており、その要因の一つにがん性腹膜炎に伴う腹水の存在が挙げられる。つまりCAR遺伝子導入によりT細胞の抗腫瘍能強化を行ったとしても、がん性腹水が存在する難治性卵巣がん患者の腹腔内では、その傷害活性が高度に消失してしまうと考えられる。本研究では、難治性の進行・再発卵巣がんでの腹腔内免疫抑制環境を突破する新しいCAR-T細胞療法の創成を目的とする。

本研究ではヒト臨床検体サンプルとゲノム編集技術を用いた機能遺伝子のゲノムワイドスクリーニング法とを用いて、免疫抑制環境を解除する遺伝子を同定し、卵巣がんの腹腔内微小環境において有効な新規CAR-T遺伝子改変手法を確立する。具体的にはヒト19,050遺伝子に対するsgRNAがデザインされたCRISPR/Cas9プールライブラリーシステム (human Genome-Scale CRISPR Knock-Out (GeCKO)) を利用して多種の遺伝子をノックアウトしたT細胞及びCAR-T細胞を調整し、それらに卵巣がん患者由来の腹水を投与することで、抑制状態を突破して機能する細胞を抽出、当該細胞群に濃縮されたsgRNA配列を指標に機能遺伝子を同定する。同定した機能遺伝子から候補遺伝子の絞り込み、それらをノックアウトしたCD19及び抗MSLN CAR-T細胞を作製して、卵巣がん腹膜播種モデルマウスにおいて薬効・動態の評価を行い、その有用性を検証する。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度の研究により、以下の内容に関する検討を行った。

ヒト19,050遺伝子に対するsgRNAがデザインされたCRISPR/Cas9プールライブラリーシステム (GeCKO)を作成した。遺伝子の大量増幅を完了し、均一な状態であることをNGS解析にて確認した。またスクリーニング用の細胞集団として抗MSLN CAR-T細胞の作成を行い、スクリーニングに向けた条件検討を実施している。

今後の研究の推進方策

上記CAR-T細胞にGeCKO sgRNAライブラリーレンチウイルスを感染させ、スクリーニング用細胞集団を取得する。この際に1細胞あたりsgRNAが複数導入されないように、sgRNAレンチウイルスベクターのMOIを0.3以下に調製して感染させる。活性化の抑制のために数日培養を行った後、セルソーターによって6,000万個の活性化細胞を取得する。ゲノムDNAを抽出することで、NGS解析を行うためのテンプレートとする。作製したテンプレート及び指定されたPCRプライマーを用いてNGSライブラリーを調製する。詳細な手順については、ブロード研究所が公表しているプロトコールに準じて行い、イルミナ社のHi-SeqあるいはNova-Seqによって、シークエンスリードを取得する。得られたリード配列のRIGER分析から、候補遺伝子を取得する。得られた候補遺伝子の文献調査を行い、新規性のある因子から順位付けされた遺伝子に対して複数のsgRNAを設計し機能解析を行う。

報告書

(1件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 研究成果

    (6件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Tumor-associated fibrosis: a unique mechanism promoting ovarian cancer metastasis and peritoneal dissemination2024

    • 著者名/発表者名
      Fujimoto Hiroki、Yoshihara Masato、Rodgers Raymond、Iyoshi Shohei、Mogi Kazumasa、Miyamoto Emiri、Hayakawa Sae、Hayashi Maia、Nomura Satoshi、Kitami Kazuhisa、Uno Kaname、Sugiyama Mai、Koya Yoshihiro、Yamakita Yoshihiko、Nawa Akihiro、Enomoto Atsushi、Ricciardelli Carmela、Kajiyama Hiroaki
    • 雑誌名

      Cancer and Metastasis Reviews

      巻: - 号: 3 ページ: 1037-1053

    • DOI

      10.1007/s10555-024-10169-8

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / 国際共著
  • [学会発表] Meflin-positive cancer-associated fibroblasts exhibit anti-tumor effect _in advanced ovarian cancer _through regulation of inhibition of peritoneal dissemination.2023

    • 著者名/発表者名
      宮本絵美里、吉原雅人、杉山麻衣、小屋美博、山北由彦、藤本裕基、伊吉祥平、茂木一将、宇野枢、田野翔、北見和久、梶山広明
    • 学会等名
      第75回日本産科婦人科学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Nerve growth factor receptor (NGFR) contributes progression of ovarian cancer through promoting proliferation and invasion.2023

    • 著者名/発表者名
      宮本絵美里、吉原雅人、杉山麻衣、小屋美博、山北由彦、藤本裕基、伊吉祥平、茂木一将、宇野枢、北見和久、那波明宏、梶山広明
    • 学会等名
      第82回日本癌学会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 進行卵巣癌における_Meflin陽性cancer associated fibroblasts(CAFs)が腫瘍進展、_生命予後に与える影響2023

    • 著者名/発表者名
      宮本絵美里、吉原雅人、杉山麻衣、小屋美博、山北由彦、藤本裕基、伊吉祥平、茂木一将、宇野枢、田野翔、北見和久、梶山広明
    • 学会等名
      日本臨床分子形態学会第55回総会・学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] Identification of LRRN4 as a potential marker for non-activated mesothelial cells in the peritoneal cavity2023

    • 著者名/発表者名
      Kazuhisa Fujita, Masato Yoshihara, Mai Sugiyama, Yoshihiko Yamakita, Yoshihiro Koya, Kazuhisa Kitami, Shohei Iyoshi, Kazumasa Mogi, Kaname Uno, Hiroki Fujimoto, Emiri Miyamoto, Kiyosumi Shibata, Hiroaki Kajiyama
    • 学会等名
      第75回日本産科婦人科学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
  • [学会発表] 進行卵巣癌腹膜播種の病勢制御を目指した腫瘍随伴性線維化機構の解明に関する研究2023

    • 著者名/発表者名
      吉原雅人、藤本裕基、宮本絵美里、茂木一将、伊吉祥平、宇野枢、北見和久、杉山麻衣、山北由彦、小屋美博、那波明宏、梶山広明
    • 学会等名
      第61回日本癌治療学会学術集会
    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 招待講演

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公開日: 2023-07-04   更新日: 2024-12-25  

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