| 研究課題/領域番号 |
23K19222
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| 研究種目 |
研究活動スタート支援
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| 配分区分 | 基金 |
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| 審査区分 |
0403:人間医工学およびその関連分野
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
小川 勇 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 助教 (40982525)
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| 研究期間 (年度) |
2023-08-31 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2024年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 腸管免疫 / 濾胞被蓋上皮 / M細胞 / 腸管オルガノイド / iPS細胞 / 腸内細菌叢 / 粘膜組織 / 共培養 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
腸管免疫は人体の健康を維持する上で非常に重要である。外界と体内を隔てる腸管細胞、特に病原体の輸送に関わるM細胞が豊富に存在する濾胞被蓋上皮領域は生体防御の入り口であり、免疫反応において大きな役割を果たす。現在汎用されている動物実験の代替として、ヒトiPS細胞由来の濾胞被蓋上皮の分化誘導法を確立し、さらにマウス由来細胞でも同様の濾胞被蓋上皮と免疫細胞、腸内細菌を用いたin vitro評価モデルを作製することにより、ヒトとマウスとの比較を行い、ヒト体内における腸管免疫のはたらきを予測可能な評価モデルの作製を目指す。
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| 研究実績の概要 |
粘膜組織には免疫に関わる細胞が多数存在し、生体防御を行う重要な器官である。M細胞は免疫系細胞が多く集まるパイエル板の上に存在し、腸管内腔から抗原を採取してパイエル板へ輸送する役割を担う。M細胞の分化や機能に関わる研究は主にマウスを用いて行われているが、in vivo実験では非侵襲的な解析が困難であり、またヒトとの種差もあることから、新たなin vitro評価系が強く望まれている。腸管オルガノイドをセルカルチャーインサート上で特殊な条件で培養することにより陰窩-絨毛様の腸管細胞（hIC）の培養に成功した。その腸管細胞には僅かだがM細胞を確認している。本研究では、ヒトiPS細胞からM細胞を豊富に含む粘膜上皮領域（FAE）への分化に特化した分化誘導を行い、ヒトM細胞の機能を観測可能な評価系を作製する。
また、倫理的課題等によりヒトin vivo研究は大きく制限されており、本研究で作製するin vitro腸管免疫評価モデルの精確性を担保することは困難である。そこで、マウスFAEも同様に作製し、FAEと細菌、免疫細胞の共培養を行い、in vivoに替わる生体腸管を模倣した腸管免疫評価系を構築することを目指す。その結果をin vivoと比較することで、in vitro評価モデルが適切にin vivoを模倣しているかの確認を行う。
腸管幹細胞からFAEへの分化誘導において最も重要な因子としてRANKLが挙げられる。まずは遺伝子導入によりRANKL産生細胞を作製し、培養上清から精製を行った。また、細菌の取り込み評価を行うため、使用するセルカルチャーインサートの孔径を0.4μmから1.0μmに変更し、hIC培養プロトコールの最適化を行った。マウス腸管組織から腸管幹細胞の単離及び腸管オルガノイド培養を行った。今後、FAEへの分化誘導法を確立し、マウスin vitro腸管免疫評価モデルを完成させる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
FAEの分化誘導において最も重要な因子であるRANKLについて、分化誘導プロトコールの検討に十分な量を確保するため、遺伝子導入によるRANKL産生細胞の作製を行った。増幅困難な配列がありプラスミド作成に時間を要した。また、セルカルチャーインサートの孔径の変更にあたり、従来のプロトコールでは細胞増殖や形質が悪化したため、播種細胞数や分化誘導因子の添加期間等の調整を行いプロトコールの最適化を行った。解析予定の経上皮電気抵抗（TEER）について、測定器の納期が遅れている。TEERは腸管バリアにおいて重要な要素であり、分化誘導の検討が行えていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
RANKLは精製済みであるため、濃度測定及びRAW264細胞を用いた活性評価を行い、分化誘導実験に使用可能であることを確認する。また、TEER測定器が入手できるまでマウス腸管組織からの腸管幹細胞単離、腸管オルガノイド培養・凍結保存を行い、細胞のストックを行う。測定器入手後、分化誘導の検討を行い、TEER、遺伝子発現、タンパク質発現の評価を行う。また、マウスにおいては脾臓から単離した免疫細胞や骨髄由来樹状細胞を用いて共培養系の確立を行う。
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