| 研究課題/領域番号 |
23K20281
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| 補助金の研究課題番号 |
20H02903 (2020-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2020-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38020:応用微生物学関連
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
土居 克実 九州大学, 農学研究院, 教授 (40253520)
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| 研究分担者 |
田代 康介 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00192170)
廣政 恭明 九州大学, 農学研究院, 准教授 (40291934)
岩本 武夫 東京慈恵会医科大学, 医学部, 非常勤講師 (90568891)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2024年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
2023年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
2022年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
2021年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
2020年度: 7,540千円 (直接経費: 5,800千円、間接経費: 1,740千円)
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| キーワード | バクテリオファージ / Thermus thermophiles / 溶原性ファージ / Geobacillus kaustophilus / 水平伝播 / ファージ / トランスクリプトーム / プロテオーム / Transposase / 誘発 / 繊維状ファージ / トランスポゼース / 主要外殻タンパク質遺伝子 / Geobacillus jurassicus / 好熱性微生物 / 感染防御機構 / 溶菌性ファージ / 分泌 / 好熱性ファージ / Inovirus / Thermos thermophilus / M13 / 一本鎖DNA結合性タンパク質 / ゲルシ フトアッセイ / サーマルシフトアッセイ / Inoviridae / 極限環境 / 遺伝子水平伝播 / 遺伝子進化 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、これまでに報告例のない好熱性繊維状ファージの宿主認識、DNA複製、転写・翻訳、分泌など生活環に関わる分子機構と遺伝子機能を明らかにし、常温性繊維状ファージのそれらと比較する。また、転移酵素遺伝子をゲノム上にもつ繊維状ファージDNAの溶原化と切出し機構を解明し、極限環境下での遺伝子水平伝播の機構を解明する。さらに、溶菌を伴わない繊維状ファージ感染を宿主細胞が「侵入」と認識して応答するか否かを、溶菌ファージ感染に応答する獲得免疫システムの経時的転写プロファイルとの相違を基に解明して、好熱性繊維状ファージに対応する獲得免疫システム調節因子の存在を究明する。
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| 研究実績の概要 |
好熱性繊維状ファージΦOH16ゲノム上に座乗するトランスポゼース様遺伝子(tnp)及び主要外殻タンパク質遺伝子（mcp）に着目した。
一部のThermus属細菌ゲノム上にΦOH16ゲノムと相同な領域が見つかっており、ΦOH16由来Tnpが働いた痕跡として考えられた。しかし、ΦOH16由来tnpコードタンパク質の転移活性は不明のため、tnpの機能解析を行った。まず、ΦOH16由来tnp遺伝子を大腸菌内で発現、精製後、ゲルシフトアッセイを行った。その結果、認識配列含有プローブDNAのみがTnp結合能を示し、タグ付加Tnpに比べタグ除去Tnpを加えた場合が移動度が小さい事から、TnpはN末端側にDNA認識または結合に関わるモチーフを持つことが推測され、認識配列非含有プローブDNAへのTnpの結合も同様であった。Thermus属ゲノムにはファージ遺伝子が順序通りに組み込まれており、ΦOH16 Tnpはtnpと隣接遺伝子間の領域を認識して結合するが誤った切断・転移を防ぐ制御機構の存在が推察された。
一方、繊維状ファージの分泌に関与する主要外殻タンパク質（MCP）の機能を解明するため、本遺伝子をpTXB1ベクター及びpSix4ベクターにより、大腸菌およびT. thermophilusに導入して組換えタンパク質を発現させたところ、MCPは大腸菌でも好熱菌でも不溶性タンパク質として生産された。MCPの膜貫通領域の疎水性残基により可溶化が阻害されると推察した。
また、新たな好熱性ファージを探索するため、アイスランドの地熱域から熱水を採取し、これらを25種のGeobacillus属細菌を指示菌とした二重寒天法により単離を行った。その結果、Krysuvik及びHveradalirの熱水（約70℃）からGeobacillus jurassicusに感染する溶菌性ファージを単離した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
未知であった好熱性繊維状ファージのゲノム組込み機構について、新たな知見が解明された。これは、ΦOH16プロファージ様領域がゲノムから切り出された後、推定Tnpが機能することで再構築されるプロモーターの下流には、繊維状ファージのDNA複製補助タンパク質gIIpをコードすると予測したorfが位置していることから、ΦOH16プロファージが切り出されると、まず推定gIIpの転写を促進する構造をとっており、ファージDNAを効率よく複製するための仕組みであると考えられる。このgIIpの上流のプロモーター再構築は、常温性繊維状ファージNfのプロファージ領域にも見られ、効率的なプロファージ誘導をIS110ファミリーTnpが担っていることが示唆された。これらは、繊維状ファージが生息する温度帯に関わらず類似の機構で宿主ゲノムに組み込まれるという、新たな知見を示すものである。
また、主要外殻タンパク質の膜貫通領域の疎水性残基により可溶化が妨げられていると推察され、今後は目的タンパク質を失活させずに取り出すことができる界面活性剤の選択、及びその使用条件を最適化する手がかりを得ることができた。
さらに、世界でも有数の地熱地帯であるアイスランドから、これまで単離例のないGeobacillus jurassicusのファージが単離できたことも、次年度以降の研究材料としての利用が期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は本研究の最終年度であり、まずこれまでの研究成果で未解明であった点を明らかにし、研究のまとめを行う。さらに、新たに単離した好熱性ファージの性状を明らかにすることで、新たな好熱性ファージの環境応答・宿主応答機構研究の進展を図る。
また、今年度構築したアイスランド大学研究者との連携をさらに深化させ、次年度以降の好熱性ファージ研究についての国際プログラムの構築を図る。
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