| 研究課題/領域番号 |
23K20313
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| 補助金の研究課題番号 |
20H03437 (2020-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2020-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分48040:医化学関連
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
佐藤 卓也 横浜市立大学, 医学部, 講師 (70599505)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2024年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2023年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2022年度: 3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)
2021年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
2020年度: 3,250千円 (直接経費: 2,500千円、間接経費: 750千円)
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| キーワード | 精巣オルガノイド / セルトリ細胞 / in vitro精子形成 / 多能性幹細胞 / 体外精子形成誘導 / 精子形成 / オルガノイド / in vitro / 器官培養 / Treck |
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| 研究開始時の研究の概要 |
精巣組織片を用いた器官培養法によって、マウスの精子幹細胞から精子へ至る精子形成過程の全てをin vitroで再現することが可能になった。しかし、マウス個体由来の精巣組織に依存した方法であることが、研究をすすめる上での様々な制限をもたらしている。そこで本研究は、多能性幹細胞(胚性幹(ES)細胞)から精巣オルガノイドを作製法を開発することで、精子形成の“場”を創出し、動物個体に依存しない完全なin vitro精子形成誘導システムを確立することを目的としている。
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| 研究実績の概要 |
精子形成過程には、精子幹細胞から精子完成へと向かうまで様々な分化段階が存在し、その過程ですべての生殖細胞はセルトリ細胞に接しながら、そのサポートを受けている。
精巣は、精細管と呼ばれる管状構造の組織を主体とした臓器で、精子形成はその精細管内部で行われる。精細管を構成する主要な体細胞はセルトリ細胞であり、そのサポートを受けながら精子形成過程は進行する。本研究は、精子形成の場である精細管をde novoに創り出すことを目的とする。そのための重要なステップとして、精細管の主要構成細胞であるセルトリ細胞を多能性幹細胞から分化誘導する方法の確立をする。
これまでの実験によって、種々の成長因子と転写因子の過剰発現によって、マウスES細胞からセルトリ細胞を低効率ながら誘導できることが分かっている。さらなるセルトリ細胞の誘導効率と精度を高める転写因子のセットを特定するための、スクリーニング実験を実施した。Tet-Onシステム誘導型の転写因子発現レンチウイルスプールをAmh-GFP ES細胞に感染させ後、分化誘導を行いDoxによって遺伝子発現誘導を行った。GFPを発現する細胞をセルソーターでソーティングした。そして、それらの細胞に導入された転写因子を次世代シーケンサーで解析し特定することで、セルトリ細胞の分化誘導に寄与した転写因子群を特定した。その結果、１０個の候補遺伝子を特定できた。
また、誘導セルトリ細胞の機能アッセイ法としてTRECK法と器官培養法を用いたin vitroセルトリ細胞置換法を開発し、有用性を検討した。その結果、移植したセルトリ細胞による内在性セルトリ細胞の置換とその後の精子形成誘導を確認することができた。また、マウス精巣をラットセルトリ細胞で置換できることも確認した。以上の結果から本実験系は誘導されたセルトリ細胞の精子形成支持能を評価する上で有用な手法を提供すると期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Amh-GFPを発現した細胞からセルトリ細胞の分化誘導に関与する推定できる候補遺伝子を絞り込むことができた。また、セルトリ細胞の体外置換法を開発することに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、この１０個の転写因子を導入したES細胞を樹立し分化誘導を行い、分化誘導効率が向上するかどうかの検証を行いたい。また、誘導されたセルトリ細胞がセルトリ細胞であるかを確認するため、RNA-seqを行うとともに、移植法を用いて、その細胞機能を明らかにする計画である。また同時に、１０個の転写因子から真に必要な遺伝子を洗い出すため、一つの転写因子を除く9因子を導入する実験を行い、不必要な転写因子を決定することで、さらに絞り込みをかける計画である。
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