| 研究課題/領域番号 |
23K21308
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| 補助金の研究課題番号 |
21H02474 (2021-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2021-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分44010:細胞生物学関連
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
駒田 雅之 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (10225568)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2024年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2023年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2022年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
2021年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
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| キーワード | メンブレントラフィック / 脱ユビキチン化酵素 / USP8 / クッシング病 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
脱ユビキチン化酵素USP8はエンドサイトーシス、オートファジー、エキソサイトーシスなどの細胞内小胞輸送（メンブレントラフィック）経路を制御することが明らかになりつつある。本研究では、USP8がこれらの輸送を制御するしくみを分子レベルで解明し、複数の経路が合目的的に調節されることを明らかにする。一方、難治性疾患クッシング病は、USP8に遺伝子変異が生じて発症することがわかっている。本研究では、変異型USP8が小胞輸送の異常を介してクッシング病を引き起こす分子機構も明らかにする。最終的に、USP8を介した多彩なメンブレントラフィックの制御を統合的に理解し、その生理的・病理的意義を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、脱ユビキチン化酵素ubiquitin-specific protease 8（USP8）が種々のメンブレントラフィック経路を制御する分子機構の解明を目指している。
エンドソームを介したメンブレントラフィックのUSP8による制御については、まず、エンドソームに存在するR-SNAREであるVAMP2とVAMP8、およびこれらと複合体を形成するQ-SNAREに着目して解析を進めた。その結果、USP8はVAMP2、VAMP8、STX7を脱ユビキチン化することがわかった。STXと複合体を形成しているVAMP8を免疫沈降法で濃縮したところ、意外なことに複合体内のVAMP8のユビキチン化が検出された。
HIV1型レンチウイルスの感染細胞からの出芽の制御については、これまでに、Gagがユビキチン化を受けることが報告されていた。今回、細胞染色によりUSP8とGagが核周辺および細胞膜上の斑点状の領域で共局在すること、免疫沈降によりUSP8とGagが結合することを明らかにした。USP8の発現抑制によりGagのユビキチン化が増加したことから、USP8がGagを脱ユビキチン化することがわかった。さらに、USP8の活性阻害により、ウイルス産生細胞におけるGagとウイルスRNAの結合量が増加し、ウイルス粒子に動員されるウイルスRNAの量も増加した。
クッシング病で見られる変異型USP8は、ACTHの分泌を過剰に促進して疾患発症を引き起こす。以前、我々はUSP8に自己阻害ドメインが備わっていることを見つけていた。2021年度は、クッシング病で見られる変異によってUSP8は自己阻害がかからない状態となり、恒常的に活性化することを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
今年度は、まず、エンドソームのメンブレントラフィックに重要なSNAREタンパク質のいくつかがUSP8の標的タンパク質であることを明らかにすることができた。さらに、当初はユビキチン化がSNARE複合体の形成を阻害すると想定していたが、意外にもユビキチン化がSNARE複合体の解離を阻害している可能性が示唆された。これを明確に示すことができれば、メンブレントラフィックの研究分野における重要な発見になると考えている。
レンチウイルスの出芽に関する解析では、ウイルス構造タンパク質GagがUSP8の基質タンパク質であることが初めて明らかとなった。さらに、USP8がGagを脱ユビキチン化するとGagとウイルスRNAの相互作用が弱まり、ゲノムRNAを含まないウイルス粒子が多く形成されるようになることが示唆された。これは、ウイルスRNAがウイルス粒子に動員される過程でGagのユビキチン化が重要な役割を果たしているという新規の知見であると言える。
クッシング病で見られる変異型USP8の解析では、疾患変異によるUSP8の恒常活性化のメカニズムを初めて明らかにすることができた。
このように、想定していなかった分子機構が次々と発見をされたため、本研究は当初の計画以上に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
エンドソームを介したメンブレントラフィックにおけるUSP8の役割の検討に関しては、これまでに、SNARE複合体がユビキチン化されると複合体の解離が阻害される可能性が示唆された。そこで、この可能性を確かめるためのタンパク質相互作用解析を進めるとともに、SNARE複合体のユビキチン化が膜融合反応に及ぼす影響を検討するためのin vitroエンドソーム融合アッセイ系を構築する。
レンチウイルスの出芽に関する解析では、これまでに、Gagのユビキチン化によってGagとウイルスRNAの相互作用が強まることを見出した。この現象の背景にある分子機構として、ユビキチン化したGagに結合する何らかのRNA結合タンパク質の存在が考えられた。そこで、今後はそのRNA結合タンパク質を同定し、Gagのユビキチン化・脱ユビキチン化によるウイルス形成の制御の分子機構の解明に迫る。
USP8がコラーゲンの分泌を抑制する現象については、以前、USP8の標的としてSec31を同定していた。Sec31はSec13と多量体を形成し、小胞体からゴルジへコラーゲンを運ぶ輸送小胞の被覆タンパク質である。今後は、Sec31のユビキチン化が被覆タンパク質の多量体の構造を変化させる分子機構を調べる。
クッシング病で見られる変異型USP8の解析では、今後、変異型USP8によって脱ユビキチン化されるタンパク質を同定するための手法の開発を進める。
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