| 研究課題/領域番号 |
23K21309
|
|---|
| 補助金の研究課題番号 |
21H02476 (2021-2023)
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(B)
|
| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2021-2023) |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
小区分44010:細胞生物学関連
|
|---|
| 研究機関 | 名古屋大学 |
|---|
研究代表者 |
増田 章男 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (10343203)
|
|---|
| 研究分担者 |
石垣 診祐 滋賀医科大学, 神経難病研究センター, 教授 (40378170)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
|
| 配分額 *注記 |
17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)
2024年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2022年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2021年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
|
|---|
| キーワード | 天然変性領域 / スプライシング / 液ー液相分離 / RNA結合タンパク / 神経変性疾患 / エクソン / 相分離 / IDR |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
筋萎縮性側索硬化症に代表される神経変性疾患では、RNA代謝異常が重要な病因であることが判明しています。しかし、RNA代謝が生理的にどのように行われているのか、その機構の詳細は、まだ十分に解明されていません。本研究では、RNA代謝を司るRNA結合タンパクの天然変性領域に焦点を当て、その配列とRNA代謝におけるルールを明らかにすることで、神経変性疾患の病態解明に迫ります。
|
| 研究実績の概要 |
Bioinformatics解析による天然変性領域 (IDR)の分類を行った。Annotation databaseからヒト蛋白の全配列情報を入手し、アミノ酸の組成/電荷/疎水性情報をもとにIDR領域配列の分類を行った。6種類のクラスターへの分別に成功し、IDRを持つRNA結合タンパク (RBP)が特に集積しているクラスターを2つ発見した。これら2つのクラスターは、特にIDR領域のアミノ酸電荷に違いが認められ、一方は無電荷、他方は激しく電荷を帯びていた。これら2つのクラスターに属するRBPから数個ずつRBPを選択し、それらのリコンビナント蛋白を作製し、in vitro 相分離実験を行ったところ、無電荷IDRと有電荷IDRは、著しく分離する（混和しない）ことが判明した。
続いて、これらIDRを持つRBPの細胞内分布を高精細に観察するため、サンプルの固定法から染色・検出法に至るまで様々な条件検討を行い、超解像顕微鏡を用いた免疫染色観察系、さらには、超解像顕微鏡観察に頼らないexpansion microscopy法の確立に成功した。確立手法を用いて培養細胞やマウス・ヒト組織切片の観察を行ったところ、20種以上のRBPがRNAと一体となって径10 nm程度のfiberを形成し、それらが複雑に絡み合った径100-400nmほどのポアサイズの網目構造を核内に広げていることを発見した。
細胞実験を行ったところ、無電荷IDRを持つRBPと有電荷IDRを持つRBPは、密接に絡み合うものの混和しない網目構造を核内で広げており、その空間分布の競合を行っていた。我々の開発したtRIP法により、生体内RBP-RNA結合解析をトランスクリプトームワイドに行ったところ、この競合が、RNA結合、さらにはRNA processingの制御につながっていることが明らかとなった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
超解像顕微鏡実験系の構築により、RBPによる核内網目構造の同定に成功した。この構造は、全く新規の発見であるため、その検証に、別方式の超解像顕微鏡による観察や、さらには超解像顕微鏡によらないexpansion microscopy観察法など、当初予定していない観察系の構築が必要となった。様々な条件検討を行って、これら新規の観察系を立ち上げていくこととなったため、研究進捗状況が予定より遅れることとなった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
RBP網目構造によるRNA processing制御がどれほど汎用的な構造であるか確認するため、各種RBPの抗体染色による核内検出網目構造検出、各種RBPのtRIP解析、各種RBPのノックダウンによる機能解析を進めていく。
また、MATR3患者変異を導入した細胞実験系の確立し、RBP網目構造と病態の関係の解析を行う。
以上、研究成果を取りまとめ、速やかに論文発表を行っていく。
|
