| 研究課題/領域番号 |
23K21319
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| 補助金の研究課題番号 |
21H02517 (2021-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2021-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分44040:形態および構造関連
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
井川 智子 千葉大学, 大学院園芸学研究院, 准教授 (00360488)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2025年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2024年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
2023年度: 2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)
2022年度: 4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2021年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
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| キーワード | 重複受精 / 膜タンパク質 / 配偶子融合 / 被子植物 / 細胞膜 / 受精因子 / 配偶子膜融合 / 配偶子 / 膜融合 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
オス精細胞膜タンパク質であるGCS1はメスの配偶子である卵細胞および中央細胞と融合するための膜融合因子である。我々はGCS1を人工的にメスの卵細胞で発現・分泌させるシロイヌナズナ組換え体を作製し，この組換え体の雌ずい組織を材料として，卵細胞から分泌されたGCS1と相互作用するタンパク質を捕捉し、プロテオーム解析を行っていた。本研究ではプロテオーム解析の結果から候補として選定した同定タンパク質の機能検証による新たな受精因子の発見を目的とする。さらにDMP9を含めた既知受精因子との相互作用解析を生化学的、細胞学的に追究することで重複受精を制御する分子メカニズムの解読を目指す。
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| 研究実績の概要 |
R4年度では，配偶子膜融合因子であるGCS1と相互作用するタンパク質種のプロテオーム解析結果より，検出信頼度が高いタンパク質種の中から「雌性組織での発現が期待されるもの」，「推定膜貫通領域を有するもの（あるいは膜局在シグナル配列を有するもの）」を主な指標として，その後の生化学及び分子生物学的解析の対象となるタンパク質種を数種選抜した。これらのタンパク質種とGCS1との相互作用を再検証するために，生化学的評価を行った。生化学的評価ではin vitroタンパク質合成とpull-downアッセイを行った。その結果，3種のタンパク質種においてGCS1との相互作用が示唆された。また別に，ベンサミアナタバコでのタンパク質発現による相互作用評価を行うため，遺伝子導入用のベクターを構築して，解析のツールを整備したた。
解析対象タンパク質種に関して局在解析を行うため，内在性プロモーターからCDSを含む領域をクローニングして，C末端側にGFP遺伝子を融合させた遺伝子発現コンストラクトを作製した。これらコンストラクトを導入したシロイヌナズナ遺伝子組換え体を得た。
上記タンパク質種において，タンパク質種Aについては，雌性配偶子の原形質膜上の局在が確認された。機能解析を行うべく，ゲノム編集によって遺伝子Aの変異個体を作出した。しかし遺伝子変異と表現型の相関が安定せず，再検証の準備を進めた。
また別のタンパク質種Bについては，CRISPR/Cas9によるゲノム編集を行い，遺伝子組換え体第1世代の種子が獲得できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
R4年度では配偶子膜融合因子であるGCS1と相互作用するタンパク質種のプロテオーム解析結果より，「雌性組織での発現が期待されるもの」，「推定膜貫通領域を有するもの（あるいは膜局在シグナル配列を有するもの）」を主な指標として，その後の生化学及び分子生物学的解析の対象となるタンパク質種を数種選抜した。これらのタンパク質種について局在解析（発現組織及び亜細胞局在解析），タンパク質発現解析を行うために遺伝子クローニング，遺伝子導入ベクター構築，シロイヌナズナ遺伝子組換え体の作出を行った。生化学的評価においては解析タンパク質種とGCS1の相互作用解析を行った。1つ目として，in vitroタンパク質合成を行い，pull-downアッセイによって評価した。その結果，3つのタンパク質種において相互作用が示唆された。今後はこれらの再現性を評価する。2つ目の解析にはNicotiana benthamianaタバコでのタンパク質発現系による評価を想定して，まず解析タンパク質種を合成させるための遺伝子導入ベクターを構築した。次年度において，こちらの評価も計画される。
上記候補タンパク質種のうち，すでに雌性配偶子での発現と原形質膜局在が確認されたものがある。これらについてCRISPR/Cas9によるゲノム編集を行い，遺伝子組換え体を作出した。一部種子稔性が低下したゲノム編集個体が得られたが，次世代において変異と表現型の相関が確認できなかったため，次年度において再検証を進めている。
解析候補タンパク質種に関し，ownプロモーターからCDS領域をクローニングしてGFP遺伝子に融合した遺伝子発現コンストラクトを導入した組換え体を得た。R5年度において，発現組織と亜細胞局在を解析する。
以上のように，解析は概ね計画どおり順調に進行した。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度行った解析では，GCS1との相互作用を示唆する生化学的な解析結果が得られている。R5年度においては，これらの検証を更に進め，再現性を確認してエビデンスデータを得る。生化学的評価においては，2タイプ以上の解析方法によって検証を行いエビデンスを得る。
雌性配偶子でGFP融合タンパク質由来のシグナルが観察された推定GCS1相互作用因子（タンパク質種A）についても，ゲノム編集個体での変異と表現型の相関を評価する。タンパク質種Aについてはシロイヌナズナゲノム上にパラログ遺伝子が存在するため，これらについても逆遺伝学的解析を行い，2重変異体なども作製して相乗性や受精との関連を表現型解析によって調査する。
もう一つのGCS1相互作用因子（タンパク質種B）についてもゲノム編集個体の表現型解析，組織及び細胞内局在解析を進める。
以上のようにR5年度においてはGCS1相互作用タンパク質の生化学的検証を十分に行い，その結果得られたエビデンスに基づいて相互作用を明らかにする。タンパク質種A及びBについては，受精における表現型を特にイメージング解析を中心に行い，機能解明を行う。
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