新規RNAメチル化解析手法に基づく肝癌mRNA制御異常の解明

• 研究課題/領域番号: 23K21431
• 補助金の研究課題番号: 21H02894 (2021-2023)
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 基金 (2024); 補助金 (2021-2023)
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分53010:消化器内科学関連
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 永江 玄太 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任准教授 (10587348)
• 研究分担者: 緑川 泰 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 病院 総合外科部, 部長 (10292905) ; 上田 宏生 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任講師 (70821916)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円); 2024年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円); 2023年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円); 2022年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円); 2021年度: 3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)
• キーワード: 肝癌 / RNA修飾 / 網羅的分析 / 網羅的解析

研究開始時の研究の概要

継続課題のため、記入しない。

研究実績の概要

本課題では生化学的および物理化学的手法を駆使し、mRNAメチル化修飾の定量的計測データを取得した上で深層学習を用いた数理最適化によって網羅性と高精度・高解像度を両立する新規検出法を確立する。この検出系を肝癌の臨床組織検体より抽出したRNAサンプルに応用することで、転写制御と転写後修飾の両面からmRNAの代謝・調節機構と癌細胞に生じている異常を明らかにする。肝癌進展過程で獲得あるいは消失するRNAメチル化修飾を同定し、標的RNAやメチル化修飾周囲の配列パターン、癌特異的修飾に関与する制御酵素や結合タンパクなどを明らかにするとともに、癌進展に関与する新規の創薬候補になりうる標的分子を見出すことを目標としている。
2023年度も引き続き、肝癌細胞株を用いたm6A修飾領域について、ダイレクトRNAシーケンスによる高解像度修飾同定法の精度向上を進めた。m6Aの修飾部位同定で使用した同じmRNAサンプルを用いて、ロングリードシーケンサー（MinION/PromethION, Oxford Nanopore Technology）によるダイレクトmRNAシーケンスを行い、修飾塩基と非修飾塩基が生じる電気信号を検出した。以上の作成したデータを畳み込みニューラルネットワークで学習させることでm6Aの修飾パターンの特徴抽出を行った。修飾塩基を材料として合成したIVT増幅RNAを用いたコントロール検体を用いた精度検証では、m6A前後の配列指向性があるものの、さまざまな配列において80%を越える正確性を確認できた。
また、ポアのversion更新に伴い、ベースコール精度と出力ファイル形式の変更などが今後想定されるため、新しい検出システム構築に向けた準備を開始した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

肝癌細胞株より抽出したRNAを用いて、m6Aメチル化修飾部位（教師データ）を作成できた。
MinIONを用いたダイレクトmRNAシーケンスを行い、200万程度の転写産物に対して、修飾塩基と非修飾塩基が生じる電気信号を出力したfast5ファイルより畳み込みニューラルネットワークでm6Aの修飾パターンを判別する一連のパイプラインを作成することができた。領域アノテーションが存在していない場合での弱教師あり学習として用いられるMultiple Instance Learningを採用することで、m6A前後の配列指向性があるものの、さまざまな配列において80%を越える正確性を確認できており、研究計画通りおおむね順調に進展していると考えられる。RNA結合タンパクの結合領域ともよく一致しており、高い検出精度うぃ達成できていると考えられる。

今後の研究の推進方策

塩基配列に対応する電気信号を、より正確にかつ高速に帰属するための新規プログラムを開発するとともに、発現量が少ない転写産物についてはリード深度が少なくなるため、少ないリード深度でも正確性が極端に下がらないようなアルゴリズムの開発をめざす。
また、ポアのversion更新に伴い、ベースコール精度と出力ファイル形式の変更などが今後想定されるため、新しい検出システム構築に向けた準備を開始する。

研究成果

• [雑誌論文] Mutational signature, cancer driver genes mutations and transcriptomic subgroups predict hepatoblastoma survival (2024)
  • 著者名/発表者名: Pire A, Hirsch TZ, Morcrette G, Imbeaud S, Gupta B, Pilet J, Cornet M, Fabre M, Guettier C, Branchereau S, Brugieres L, Guerin F, Laithier V, Coze C, Nagae G, Hiyama E, Laurent-Puig P, Rebouissou S, Sarnacki S, Chardot C, Capito C, Faure-Conter C, Aerts I, Taque S, Fresneau B, Zucman-Rossi J
  • 雑誌名: European Journal of Cancer 巻: 200 ページ: 113583-113583
  • DOI: 10.1016/j.ejca.2024.113583
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Transcriptomic and epigenetic dissection of spinal ependymoma (SP-EPN) identifies clinically relevant subtypes enriched for tumors with and without NF2 mutation (2024)
  • 著者名/発表者名: Neyazi S, Yamazawa E, Hack K, Tanaka S, Nagae G, Kresbach C, Umeda T, Eckhardt A, Tatsuno K, Pohl L, Hana T, Bockmayr M, Kim P, Dorostkar MM, Takami T, …, Ichimura K, Rutkowski S, Aburatani H, Saito N, Schller U.
  • 雑誌名: Acta Neuropathologica 巻: 147 号: 1 ページ: 22-22
  • DOI: 10.1007/s00401-023-02668-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] エピゲノム解析 (2024)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 雑誌名: がんゲノムペディア-77のキーワードで理解するゲノム医療とゲノム研究 巻: - ページ: 104-107
• [雑誌論文] RNA Oncological Therapeutics: Intracellular Hairpin RNA Assembly Enables MicroRNA-Triggered Anticancer Functionality (2023)
  • 著者名/発表者名: Morihiro, K.; Morita, S.; Harada, N.; Baba, M.; Yum, J.; Naito, M.; Miyata, K.; Nagae, G.; Okamoto, A.
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Soc. 巻: 146 号: 2 ページ: 1346-1355
  • DOI: 10.1021/jacs.3c09524
  • 査読あり
• [雑誌論文] Loss of viral genome with altered immune microenvironment during tumour progression of <scp>Epstein‐Barr virus</scp> ‐associated gastric carcinoma (2023)
  • 著者名/発表者名: Kondo Atsushi、Shinozaki‐Ushiku Aya、Rokutan Hirofumi、Kunita Akiko、Ikemura Masako、Yamashita Hiroharu、Seto Yasuyuki、Nagae Genta、Tatsuno Kenji、Aburatani Hiroyuki、Koinuma Daizo、Ushiku Tetsuo
  • 雑誌名: The Journal of Pathology 巻: - 号: 2 ページ: 124-136
  • DOI: 10.1002/path.6067
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Multiancestry genomic and transcriptomic analysis of gastric cancer (2023)
  • 著者名/発表者名: Totoki Y, Saito-Adachi M, Shiraishi Y, Komura D, Nakamura H, Suzuki A, Tatsuno K, Rokutan H, Hama N, Yamamoto S, Ono H, Arai Y, Hosoda F, Katoh H, et al.
  • 雑誌名: Nature Genetics 巻: 55 号: 4 ページ: 581-594
  • DOI: 10.1038/s41588-023-01333-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 総論：疾患の病態解明に向けた統合オミックス解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 雑誌名: 遺伝子医学 巻: 45 ページ: 1-7
• [雑誌論文] Identification of the ultrahigh-risk subgroup in neuroblastoma cases through DNA methylation analysis and its treatment exploiting cancer metabolism (2022)
  • 著者名/発表者名: Watanabe K, Kimura S, Seki M, Isobe T, Kubota Y, Sekiguchi M, Sato-Otsubo A, Hiwatari M, Kato M, Oka A, Koh K, Sato Y, Tanaka H, Miyano S, Kawai T, Hata K, Ueno H, Nannya Y, Suzuki H, Yoshida K, Fujii Y, Nagae G, Aburatani H, Ogawa S, Takita J.
  • 雑誌名: Oncogene 巻: 41 号: 46 ページ: 4994
  • DOI: 10.1038/s41388-022-02489-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Multi-omics analysis defines highly refractory RAS burdened immature subgroup of infant acute lymphoblastic leukemia (2022)
  • 著者名/発表者名: Tomoya Isobe, Masatoshi Takagi, Aiko Sato-Otsubo, et al. (57人中28番目)
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 4501-4501
  • DOI: 10.1038/s41467-022-32266-4
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 小児肝芽腫発症に関与する分化制御因子 (2022)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 雑誌名: 生化学 巻: 94(3) ページ: 438-442
• [雑誌論文] ヒトゲノム研究におけるマイクロアレイ解析(CGH・SNP・メチル化など) (2022)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 雑誌名: 病理と臨床 40(臨増)【がんゲノム医療時代の分子腫瘍学】 巻: - ページ: 057-063
• [雑誌論文] 泌尿器科領域におけるシングルセル解析の可能性 (2022)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 雑誌名: 泌尿器科 巻: 15(4) ページ: 465-471
• [雑誌論文] Genome-wide analysis of DNA methylation identifies the apoptosis-related gene UQCRH as a tumor suppressor in renal cancer (2022)
  • 著者名/発表者名: Kosuke Miyakuni, Jun Nishida, Daizo Koinuma, Genta Nagae, Hiroyuki Aburatani, Kohei Miyazono, Shogo Ehata
  • 雑誌名: Molecular Oncology 巻: 16 号: 3 ページ: 732-749
  • DOI: 10.1002/1878-0261.13040
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genetic and epigenetic basis of hepatoblastoma diversity (2021)
  • 著者名/発表者名: Nagae G, Yamamoto S, Fujita M, Fujita T, Nonaka A, Umeda T, Fukuda S, Tatsuno K, Maejima K, Hayashi A, Kurihara S, Kojima M, Hishiki T, Watanabe K, Ida K, Yano M, Hiyama Y, Tanaka Y, Inoue T, Ueda H, Nakagawa H, Aburatani H, Hiyama E.
  • 雑誌名: Nat Commun. 巻: 12 号: 1 ページ: 5423-5423
  • DOI: 10.1038/s41467-021-25430-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Base-Resolution Analysis of 5-Hydroxymethylcytidine by Selective Oxidation and Reverse Transcription Arrest (2021)
  • 著者名/発表者名: Koyama, K.; Hayashi, G.; Ueda, H.; Ota, S.; Nagae, G.; Aburatani, H.; Okamoto, A.
  • 雑誌名: Org. Biomol. Chem. 巻: 19 号: 29 ページ: 6478-6486
  • DOI: 10.1039/d1ob00995h
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular classification and diagnostics of upper urinary tract urothelial carcinoma (2021)
  • 著者名/発表者名: 藤井陽一、佐藤悠佑、鈴木啓道、川合剛人、森川鉄平、白石友一、中川徹、久米春喜、小川誠司他
  • 雑誌名: Cancer Cell 巻: 39 号: 6 ページ: 793-809
  • DOI: 10.1016/j.ccell.2021.05.008
  • NAID: 120007089270
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] TET1 upregulation drives cancer cell growth through aberrant enhancer hydroxymethylation of HMGA2 in hepatocellular carcinoma. (2021)
  • 著者名/発表者名: Shirai K, Nagae G, Seki M, Kudo Y, Kamio A, Hayashi A, Okabe A, Ota S, Tsutsumi S, Fujita T, Yamamoto S, Nakaki R, Kanki Y, Osawa T, Midorikawa Y, Tateishi K, Ichinose M, Aburatani H.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 112 号: 7 ページ: 2855-2869
  • DOI: 10.1111/cas.14897
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] direct RNA sequenceとRNA修飾の情報解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 上田 宏生
  • 雑誌名: 実験医学別冊 ロングリードWET&DRY解析ガイド 巻: - ページ: 202-212
• [雑誌論文] ナノポアシーケンサーを用いた RNA 修飾の解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 山崎 洋人、上田 宏生
  • 雑誌名: 細胞（特集 エピトランスクリプトミクス） 巻: 53(14) ページ: 896-899
• [雑誌論文] Discovering A-to-I RNA Editing Through Chemical Methodology “ICE-seq” (2020)
  • 著者名/発表者名: Sakurai, M., Okada, S., Ueda, H., and Yang, Y.
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology 巻: 2181 ページ: 113-148
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-0787-9_8
  • ISBN: 9781071607862, 9781071607879
  • 査読あり
• [学会発表] メチル化パネルアッセイによる多がん種同時検査システムの開発 (2024)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 学会等名: 第8回Liquid Biopsy研究会
  • 招待講演
• [学会発表] Whole genome and transcriptome analysis of 200 pediatric liver cancer in the JPLT study (2024)
  • 著者名/発表者名: Genta Nagae
  • 学会等名: SIOPEL 2024 annula meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Long-read DNA methylation analysis of cancer genomes using a nanopore sequencing (2023)
  • 著者名/発表者名: Genta Nagae
  • 学会等名: 第82回日本癌学会学術総会
  • 国際学会
• [学会発表] Understanding the complex patterns of DNA modification in cancer (2023)
  • 著者名/発表者名: Genta Nagae
  • 学会等名: Humang Genome Asia 2023
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Molecular mechanism of pediatric liver cancer -carcinogenic role of epigenetic dysregulation- (2023)
  • 著者名/発表者名: Genta Nagae
  • 学会等名: 日本肉腫学会第8回オープン年次学術集会プログラム
  • 招待講演
• [学会発表] ロングリードシーケンサーを用いた新たながんエピゲノム異常の解明 (2023)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 学会等名: 第38回Wakoワークショップ
  • 招待講演
• [学会発表] Spatial dissection of cellular heterogeneity in human cancer tissues (2023)
  • 著者名/発表者名: Genta Nagae
  • 学会等名: 第46回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Biological/pathological features of childhood liver tumors (2023)
  • 著者名/発表者名: Nagae G
  • 学会等名: SIOPEL annual meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 小児肝がんの統合的ゲノム・エピゲノム解析による病態理解と患者層別化 (2022)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 学会等名: 第60回日本癌治療学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] Long-read DNA methylation analysis of hepatoblastoma genomes using a nanopore sequencing (2022)
  • 著者名/発表者名: Nagae G, Umeda T, Ueda H, Aburatani H.
  • 学会等名: The 81th Japan Cancer Association Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] メチル化パネルアッセイによる血中腫瘍DNA検出系の開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 学会等名: 第42回日本分子腫瘍マーカー研究会
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 小児肝がんの統合的ゲノム・エピゲノム解析による病態理解と患者層別化 (2022)
  • 著者名/発表者名: 永江玄太
  • 学会等名: 第17回北関東小児がんセミナー
  • 招待講演
• [学会発表] Next future trial for childhood liver tumors (2022)
  • 著者名/発表者名: Nagae G
  • 学会等名: JCCG International brainstorming session (Asia)
• [学会発表] PHITT2, the JPLT view (2022)
  • 著者名/発表者名: Nagae G
  • 学会等名: SIOPEL Annual Meeting 2022
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Enhancer dysfunction related to the heterogeneity of liver and gastric malignancy (2021)
  • 著者名/発表者名: Nagae G
  • 学会等名: 第80回癌学会総会
  • 国際学会
• [学会発表] nanoDoc を用いた RNA 修飾の検出 (2021)
  • 著者名/発表者名: Ueda H
  • 学会等名: Virtual Nanopore Day