| 研究課題/領域番号 |
23K21495
|
|---|
| 補助金の研究課題番号 |
21H03145 (2021-2023)
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(B)
|
| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2021-2023) |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
小区分57060:外科系歯学関連
|
|---|
| 研究機関 | 九州歯科大学 |
|---|
研究代表者 |
有吉 渉 九州歯科大学, 歯学部, 教授 (40405551)
|
|---|
| 研究分担者 |
臼井 通彦 九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (10453630)
望月 慎一 北九州市立大学, 国際環境工学部, 准教授 (10520702)
安達 禎之 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (60222634)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2026-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
|
| 配分額 *注記 |
15,990千円 (直接経費: 12,300千円、間接経費: 3,690千円)
2025年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
2024年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
2023年度: 2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)
2022年度: 6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)
2021年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
|
|---|
| キーワード | 破骨細胞 / dectin-1 / β-glucan / オートファジー / 小胞体ストレス / エンドサイトーシス |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
申請者は、破骨細胞前駆細胞上に特異的に発現する免疫受容体dectin-1 が、糖鎖β-glucanの認識を介して破骨細胞分化を抑制すること、そのメカニズムとして分化のマスター転写因子であるNFATc1の負の制御の関与を明らかにした。本申請では、（1）各種β-glucanのキャラクタリゼーションと受容体の同定、（2）β-glucanのNFATc1発現抑制に関わる詳細な分子機構の解明、（3）モデル動物における骨破壊に対するβ-glucanの作用の検証の3課題について、歯工学連携による専門性の高い融合研究を展開し、骨代謝疾患や炎症性骨破壊に対する新たな治療戦略の提案を目指す。
|
| 研究実績の概要 |
免疫受容体を介した破骨細胞分化制御機構の解明や選択性の高い骨代謝疾患治療薬の開発を目指した研究を遂行する。糖鎖β-glucanは、破骨細胞前駆細胞に特異的に発現する糖鎖認識受容体dectin-1との結合を介して、破骨細胞分化のマスター因子であるNFATc1を負に制御する結果、破骨細胞分化を抑制することを見出した。さらにこの抑制作用には、sykタンパクのオートファジーを介したタンパク分解系が関与していることを証明している。分解標的タンパであるsykは、β-glucan添加後、ただちに早期エンドソームマーカーとの共局在が観察されたことから、この選択的なオートファジーの誘導には、エンドサイトーシスとの協調が関与していることが強く示唆された。これらのメンブレントラフィック制御に関わる新規遺伝子同定のため、cDNA library を作製し、シーケンサーによる解析を遂行している。
また、基質選択性のないオートファゴソームが、基質特異的にタンパク分解を行うためには、分解対象（カーゴ）の標的化が要求される。カーゴの標的化にエンドサイトーシス誘導時の液-液相分離により液滴状態となったタンパク質（END）の形成が関与するという仮説のもと、β-glucan 添加後のレセプタータンパクEps15によるENDの形成とENDへのオートファゴソーム形成に必要なユビキチン様タンパク質Atg8や足場タンパク質Atg11のリクルートを確認している。その一方で、基質特異的なタンパク分解に、標的タンパクであるsykのポリユビキチン化の関与は否定されたが、sykのリン酸化は関与していることが示唆された。
さらに、β-glucanにはNF-κB経路の抑制を介したdectin-1非依存的な破骨細胞分化の負の制御機構が存在することが確認され、これに関与する糖鎖認識受容体としてCR3が示唆された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年に引き続き、「β-glucanによるNFATc1発現抑制の分子メカニズムの解明」を主軸に研究を行った。β-glucanによるNFATc1の初期誘導に関するNF-κBの活性化抑制について確認していたCR3受容体を介するdectin-1非依存的な調節機能に関して、分子レベルでの詳細な解析を遂行した。また、β-glucanによるオートファジーを介したタンパク分解について、標的タンパクであるsykの標的化に着目した研究では、昨年度にβ-glucan添加後のdectin-1およびsykタンパクが初期エンドソームに取り込まれることを確認したことから、選択的オートファジーの１つEND選択的オートファジーに着目した検証を遂行した。その結果、この機構にリガンド結合受容体の内在化を調節するアダプタータンパク質であるEps15の関与が示唆された。
加えて、メンブレントラフィック制御機構のさらなる解明のため、研究計画調書の記載通り、β-glucanで刺激した破骨細胞前駆細胞における遺伝子の発現変化についてRNA-seqを実施した。すでにwet解析はしており、転写産物の発現定量、発現変動した遺伝子群の検出や機能の推定のためのdry解析に取り組んでいる。
付随研究として、口腔バイオフィルムを構成する糖鎖α-glucanについて、ともにグルコースより構成されるβ-glucanとは、生物学的活性が大きく異なることを明らかしていた。口腔感染症の制御という観点から、α-glucanの成分分析および破骨細胞分化修飾能の解明のため、質、量ともに担保されたα-glucanの精製にも着手している。加えて、β-glucanの構造解析やモデル動物を用いた歯周病モデルに対する検討も引き続き実施しており、骨代謝疾患に対する新たな治療戦略確立に向けた研究活動を行う。
|
| 今後の研究の推進方策 |
1. 破骨細胞分化修飾に関わるβ-glucanのキャラクタリゼーションと受容体の同定：dectin-1に加え、CR3についてβ-glucanとの結合能を評価する。またα-glucanは、現状の精製プロトコールでは、多量の塩の混在が予想された。そこで、プロトコールを改変し、脱塩処理を追加し、より純度の高いα-glucanを精製し、成分分析を行う。
2. β-glucanによるNFATc1発現抑制の分子メカニズムの解明：β-glucanによる破骨細胞分化のマスター因子NFATc1の発現抑制に関わるそれぞれの候補機構について分子レベルでの解析を実施する。（1）NF-κB経路の活性化抑制：β-glucanとCR3の相互作用によるNF-κB経路の修飾機構の詳細を解明する。（2）sykのオートファジーを介したタンパク分解；1）オートファゴソームの誘導・制御に対するEPS15の関与を明らかにする。2）メンブレントラフィック制御機構解明のために、β-glucanで刺激した破骨細胞前駆細胞における遺伝子の発現変化についてRNA-seqを実施した。得られたデータを解析し、転写産物の発現定量、発現変動した遺伝子群の検出や機能の推定を行う。3）β-glucanによる小胞体ストレスセンサーであるIRE1の発現増強に伴うIRE1-XBP経路の活性化について検証する。4）sykのリン酸化によるオートファゴソームの基質特異的なタンパク分解誘導への関与を同定する。（3）カルシウムシグナリングの修飾：β-glucanによる破骨細胞分化誘導時の細胞内カルシウム動態修飾に関与する細胞内シグナルナル分子を同定する。
3. 動物実験:ラット歯周炎モデルに対するβ-glucanの投与実験の結果、得られた標本について解析を行う。一方、-OH基を付加し、水溶性を高めたβ-glucanの破骨細胞分化抑制能も評価する。
|
