| 研究課題/領域番号 |
23K21513
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| 補助金の研究課題番号 |
21H03183 (2021-2023)
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 基金 (2024)
補助金 (2021-2023) |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分58020:衛生学および公衆衛生学分野関連:実験系を含む
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
高橋 忠伸 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (20405145)
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| 研究分担者 |
大坪 忠宗 広島国際大学, 薬学部, 准教授 (30365879)
池田 潔 広島国際大学, 薬学部, 教授 (40168125)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2024年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2023年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
2022年度: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)
2021年度: 6,890千円 (直接経費: 5,300千円、間接経費: 1,590千円)
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| キーワード | シアリダーゼ / インフルエンザウイルス / ノイラミニダーゼ / 蛍光イメージング / 増殖 / 酵素 / 流行 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
A型インフルエンザウイルスが細胞内への侵入に利用するエンドソーム・リソソームは細胞内の酸性環境であることから、シアリダーゼの酸性安定性に影響することが予想される。細胞侵入過程におけるA型インフルエンザウイルスのシアリダーゼ活性の挙動を解析する。シアリダーゼ活性の安静安定性が異なるウイルス株間で比較することで、このシアリダーゼ活性の挙動に違いが見られるのか調査する。さらに、この違いから生じる細胞内すぐなるや現象について解析する。さらに、実際に自然界で発生した2009年パンデミック後のシアリダーゼ活性の酸性安定性の変化について調査する。
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| 研究実績の概要 |
ヒトのA型インフルエンザウイルスは数十年に一度、新型（新抗原性）インフルエンザによる世界大流行（パンデミック）を起こす。インフルエンザウイルスの表面酵素ノイラミニダーゼ（NA）の酵素性状の一つである酸性安定性は、季節性ウイルスではほぼ見られず、過去のパンデミックを起こしたすべてのウイルスに見られる特有の酵素性状である。この酵素性状は培養細胞レベルでウイルス増殖を促進させることから、当時のパンデミック発生に貢献する一要因の可能性が考えられた。本研究では、NAの酸性安定性に基づく細胞レベルのウイルス増殖促進機構を解析し、パンデミック発生に貢献する宿主細胞側の要因を解明する。NAの酵素性状やこの性状を介した機構は、パンデミックを予測する指標に利用できるものと期待される。
インフルエンザウイルス細胞侵入過程のNAのみにおける細胞への影響を解析するため、前年度までバキュロウイルス-タンパク質発現システムを利用して、エンドサイトーシスシグナル配列を付加した四量体化NAの大量産生を構築していたが、収量が少なく細胞に適用する実験には至らなかった。NAの酸性安定性は、ウイルスの細胞侵入過程の酸性環境下に影響することが予想される。細胞侵入過程のウイルスシアリダーゼ活性の挙動を解析するための手法の開発を試みた。過去に開発した既報の蛍光剤BTP9-Neu5Acを使用して、糖鎖修飾を受けるためにインフルエンザウイルス感染細胞内のゴルジ装置に一時的に局在化したウイルス新生NAのシアリダーゼ活性を蛍光イメージングする手法を開発し、報告した。また、この手法に使用するための新規蛍光剤の候補も開発した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
最も力を入れていたバキュロウイルス-タンパク質発現システムによるNAの大量生産系は、収量が乏しい問題を改善することができなかった。別の研究手法として、細胞内ウイルスシアリダーゼ活性の蛍光イメージング手法の開発やその蛍光剤の開発を進めることができた。過去に開発した既報の蛍光剤を使用して、インフルエンザウイルス感染細胞内のゴルジ装置に局在化したNAのシアリダーゼ活性の蛍光イメージングに成功し、報告した。また、この手法に使用するための新規蛍光剤の候補も開発した。これらは新しい手法や蛍光剤であり、今後の研究の大きな進展が期待される。そのため、進捗状況は「やや遅れている」と判定した。
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| 今後の研究の推進方策 |
A型インフルエンザウイルスはエンドサイトーシスを介して細胞内へ侵入する。エンドソーム・リソソームは細胞内の酸性環境であることから、シアリダーゼの酸性安定性に影響することが予想される。そこで、細胞内への侵入過程におけるウイルスNAのシアリダーゼ活性の挙動を解析する。細胞内シアリダーゼ活性を蛍光イメージングする上で、過去に開発したシアリダーゼ蛍光イメージング剤を利用した場合、NAの免疫染色されない場所にさえ、非特異的と考えられる蛍光像が生じた。そこで本年度は、この課題を克服した新規蛍光剤を開発する。候補の蛍光剤はすでに合成しており、これらの蛍光剤の評価を行う。
新規蛍光剤を使用して細胞侵入過程のウイルスNAのシアリダーゼ活性を経時的に蛍光イメージングし、各種オルガネラマーカーとの共免疫染色によりシアリダーゼ活性の位置を調査する。さらに、酸性安定性の異なるシアリダーゼを持つウイルス株の間で差を観察する。この過程におけるシアリダーゼ活性によって生じる細胞内シグナルと、そのシグナルに由来する現象を解析する。ウイルス株の間で、このシグナルや現象が異なるのか調査する。
2009年にH1N1型ウイルスのパンデミックが発生した。シアリダーゼ活性の酸性安定性について、過去のパンデミック後と同様な変化（酸性安定性の低下）が観察されるのか、自然界の実際の現象で確認する。2009年パンデミック由来のA型インフルエンザウイルスのシアリダーゼ活性の酸性安定性を経時的に調査する。酸性安定性の変化を起こす分子機構を解析するため、酸性安定性の変化に関わるアミノ酸置換を同定する。ウイルス株間のシアリダーゼのアミノ酸配列を比較し、異なるアミノ酸残基に置換を導入したシアリダーゼの発現細胞を使用してシアリダーゼ活性の酸性安定性を評価する。
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